Engineering Pseudomonas for the production of reduced compounds

Nies, Salome Clarissa; Blank, Lars M. (Thesis advisor); Wierckx, Nick (Thesis advisor)

1. Auflage. - Aachen : Apprimus Verlag (2022)
Buch, Doktorarbeit

In: Applied microbiology 27
Seite(n)/Artikel-Nr.: 1 Online-Ressource : Illustrationen, Diagramme

Dissertation, RWTH Aachen University, 2021

Kurzfassung

Reduzierte Verbindungen, wie z. B. Biokraftstoffe, können mit Hilfe von metabolisch veränderten Mikroben hergestellt werden. Die Produktion solcher Moleküle beruht auf einer Redox-Kofaktor-abhängigen Biokatalyse. Die Voraussetzung für eine herausragende Leistung erfordert ein grundlegendes Verständnis des Redox-Stoffwechsels des Produktionswirts, ein einfaches Redox-Chassis und ein interessantes Zielmolekül mit einem bekannten Stoffwechselweg. Diese Voraussetzungen werden in dieser Arbeit anhand des obligaten aeroben Pseudomonas taiwanensis VLB120 und Methylketonen adressiert.Der Genotyp/Phänotyp Zusammenhang der drei NADH-Dehydrogenasen der Atmungskette von P. taiwanensis VLB120 wurde untersucht. Eine Mutante, der alle drei NADH-Dehydrogenasen fehlten, schien nicht lebensfähig zu sein, während die Mutante, der beide Typ-2-Dehydrogenasen fehlten (∆∆ndh), einen deutlichen Phänotyp mit biphasischem Wachstumsverhalten und einer stark reduzierten Wachstumsrate in der zweiten Wachstumsphase zeigte. Eingehende Analysen des Metabolismus der generierten Mutanten zeigten eine Umlenkung der Stoffwechselflüsse durch erhöhte ROS-Bildung in ∆∆ndh mit gleichzeitiger Wachstumsreduktion. Diese metabolische Flexibilität kann einen stabilen, lebensfähigen Phänotyp aufrechterhalten. Die Deletion des ATP-abhängigen ABC-Transporters und des Polyhydroxyalkanoat-Synthese-Operons wurden mit den NADH-Dehydrogenase-Deletionsmutanten kombiniert, um ein potentielles Redox-Chassis für die Redox-abhängige Biokatalyse aufzubauen. Die Mutationen zeigten nur schwache Auswirkungen auf die zu messende Wachstumsrate. Eine separate NADH-abhängige Reaktion ist unabdingbar, ein NADH Sensor, um die Auswirkungen der einzelnen Gendeletionen zu untersuchen, da NADH-Online-Messungen für Pseudomonas aufgrund ähnlicher Extinktionsoptima von Pyoverdin nicht geeignet sind. Als Vertreter hochreduzierter Plattformchemikalien wurden Methylketone gewählt, die industriell aus erdölbasierten Kohlenwasserstoffen hergestellt werden. Diese finden in verschiedenen Industrien, wie z. B. der Duftstoffindustrie, Anwendung und werden als Biodieselmischungen diskutiert. Die Umsetzung der publizierten Strategien führte zu 2,1 g Laq-1 Methylketone in Fed-Batch-Fermentation. Die Umsetzung einer metabolischen Modellierungsstrategie steigerte die Produktion durch die Eliminierung von konkurrierenden Reaktionen auf 9,8 g Laq-1-Methylketone. Diese Syntheseleistung stellt eine Vervierfachung des Produkttiters im Vergleich zum Ausgangsstamm dar und ist der höchste Titer rekombinant hergestellter Methylketone, über den bisher berichtet wurde. Zusammenfassend, aus einer eingehenden Analyse und dem daraus entstandenen Wissen konnte ein effektiver Redox-Biokatalysator-Wirt für die Produktion von hoch reduzierten Chemikalien aufgebaut werden.

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