Sodium ion channels in chronic pain: modeling human pain syndromes with induced pluripotent stem cell-derived sensory neurons

Kalia, Anil Kumar; Rothermel, Markus (Thesis advisor); Lampert, Angelika (Thesis advisor); Zimmer-Bensch, Geraldine Marion (Thesis advisor)

Aachen : RWTH Aachen University (2022)
Doktorarbeit

Dissertation, RWTH Aachen University, 2022

Kurzfassung

Vererbte Mutationen in spannungsabhängigen Natrium-Ionenkanälen (Navs) verursachen Störungen der Erregbarkeit von Membranen, darunter chronische Schmerzen. Navs leiten Aktionspotenziale in erregbaren Zellen und spielen eine wichtige Rolle bei der Erkennung und Übertragung sensorischer Informationen von der Peripherie zu höheren Gehirnzentren. Neun verschiedene Nav-Kanäle (Nav1.1-Nav1.9) sind beim Menschen beschrieben worden. Nav1.7 wird bevorzugt im peripheren Nervensystem exprimiert und genetische Studien haben Funktionsverlust- und Funktionsgewinnmutationen in Nav1.7 identifiziert, die zu einer angeborenen Schmerzunempfindlichkeit bzw. zu chronischen Schmerzsyndromen führen. Navs können als Dimere vorliegen, welche die mutationsbedingten Veränderungen des Gatings moduliert. Die Translation von Forschungsergebnissen von Nagetieren auf den Menschen ist gerade in der Schmerzforschung problematisch. Humane induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) bieten ein attraktives Instrument zur Modellierung menschlicher Krankheiten. Die vorliegende Dissertation befasst sich mit dem Verständnis (a) der pharmakologischen Wirkung selektiver Nav1.7-Blocker auf Monomere und Dimere, (b) der Modellierung einer menschlichen Schmerzerkrankung mit iPSC-abgeleiteten Nozizeptoren und (c) der funktionellen Charakterisierung von iPSC-abgeleiteten sensorischen Neuronen mit einem neuartigen beschleunigten ektodermalen Differenzierungsprotokoll. Das Peptidtoxine Protoxin-II (ProTx-II) hat eine hohe Selektivität für den menschlichen Nav1.7-Kanal. In diesem Projekt wurden HEK-Zellen, die Nav1.7 stabil exprimieren und mit dem Dimerisierungsinhibitor Difopein transfiziert wurden untersucht. Patch-Clamp-Aufnahmen zeigten, dass die Behandlung mit Difopein die hemmende Wirkung von ProTx-II auf die Nav1.7-Ströme signifikant reduzierte. Dies deutet darauf hin, dass die Dimerisierung von Nav eine wichtige Rolle bei der Modulation der Wirksamkeit selektiver Nav-Blocker und damit ihres Potentials bei der Behandlung chronischer Schmerzerkrankungen spielen könnte. Die vererbte Erythromelalgie (IEM) ist eine autosomal dominante Neuropathie, die mit brennenden Schmerzen der Extremitäten und genetisch mit Funktionsgewinn-Mutationen des SCN9A-Gens, das für Nav1.7 kodiert, einhergeht. In diesem Projekt wurden Blutzellen eines IEM-Patienten, der die SCN9A-Mutation Q875E trägt, mit Hilfe der Yamanaka-Transkriptionsfaktoren zu iPSCs reprogrammiert. Isogene Kontrollen wurden durch CRISPR/Cas9-vermittelte Genome Editierung erzeugt. iPSCs wurden in Nozizeptoren differenziert. Unsere Ergebnisse zeigen eine erhöhte Erregbarkeit der Nozizeptoren und spontane Aktivität in den erkrankten sensorischen Neuronen im Vergleich zu den isogenen Kontrollen, was wahrscheinlich der Grund für die Schmerzattacken der Patientin ist. Darüber hinaus haben wir im Rahmen des multisensorischen Ansatzes festgestellt, dass warme und noxische Temperaturreize zu einer erhöhten Aktionspotential frequenz in den sensorischen Neuronen der Patientin führen. Diese Studie unterstreicht das Potenzial von iPSC-abgeleiteten sensorischen Neuronen als Modellsystem zur Untersuchung multisensorischer Ereignisse und des klinischen Phänotyps menschlicher Schmerzstörungen in vitro. Aufgrund der hohen Variabilität der derzeitigen Differenzierungsprotokolle für die Erzeugung von aus iPSC gewonnenen Nozizeptoren sind neue Methoden erforderlich. Dieses Projekt beinhaltet eine neuartige Differenzierungsmethode mit einer beschleunigten ektodermalen Induktion zur Erzeugung von sensorischen Neuronen aus iPSC. Wir fanden heraus, dass dieses Protokoll ein homogenes, dichtes neuronales Netzwerk unreifer sensorischer Neuronen innerhalb von 7 Tagen erzeugt, im Vergleich zu 10-14 Tagen mit den konventionelleren Differenzierungsprotokollen mit kleinen Molekülen. Dieses Protokoll wurde mit Zelllinien von Schmerzpatienten, die eine zelluläre Übererregbarkeit aufweisen, weiter validiert. Die Ergebnisse dieser Arbeit eröffnen neue Möglichkeiten für die Untersuchung der Mechanismen von Schmerzerkrankungen mit Hilfe von In-vitro-Krankheitsmodellen und für die Nutzung der Plattform zur Identifizierung neuartiger pharmakologischer Modulatoren von Navs für die personalisierte Behandlung, um den ungedeckten medizinischen Bedarf für die Behandlung chronischen Schmerzen zu decken.

Einrichtungen

• Fachgruppe Biologie [160000]
• Lehr- und Forschungsgebiet Neuroepigenetik [164620]
• [512000-3]