Experimental approaches to mapping the binding site of RFamides on the peptide-gated Hydra magnipapillata sodium channels (HyNaCs)

Bachmann, Michèle; Spehr, Marc (Thesis advisor); Gründer, Stefan (Thesis advisor)

Aachen : RWTH Aachen University (2022)
Doktorarbeit

Dissertation, RWTH Aachen University, 2022

Kurzfassung

Ionenkanäle der DEG/ENaC Genfamilie sind in einer verblüffenden Vielfalt physiologischer Prozesse involviert. Sie werden charakterisiert durch spannungsunabhängiges "Gating", Permeabilität für Na+ und Blockierung durch Amilorid. Neben mechanischer Stimulation aktivieren verschiedene Substanzen wie Protonen und kleine Peptidliganden einige DEG/ENaCs, während andere konstitutiv offene Kanäle bilden. Lange wurde angenommen, dass Neuropeptide nur als Liganden bei relativ langsamer metabotroper Transmission via G- Protein gekoppelter Rezeptoren dienen. Die Entdeckung der FMRFamid-aktivierten Na+- Kanäle (FaNaCs) in der Schnecke Helix aspersa, somit ein Liganden-aktivierter DEG/ENaC Kanal, verursachte eine Neuorientierung dieser traditionellen Sichtweise. Nachfolgend wurde entdeckt, dass Hydra magnipapillata Na+-Kanäle (HyNaCs) ebenfalls von kleinen endogenen Neuropeptiden namens RFamiden aktiviert werden. Die Bindestelle von RFamid I und II an HyNaCs ist noch unbekannt und wurde in dieser Arbeit untersucht. Hierfür wurde das HyNaC2/5/3 Heterotrimer zusammen mit RFamid II verwendet. Zuerst wurden die HyNaC Untereinheiten für heterologe Expression in Säugetierzellen Codon- optimiert. Durch das Anpassen der nativen HyNaC Gensequenz an die Codonpräferenz von Homo sapiens konnten wir die Gesamtproteinexpression und den durch RFamid-Bindung an HyNaCs erzeugten Strom in HEK293 T Zellen stark erhöhen. Die unbekannte Stöchiometrie der HyNaC Untereinheiten im Heterotrimer wurde durch Photo-Crosslinking mithilfe einer unnatürlichen Aminosäure enthüllt und zeigte eine strikte 2-5-3 Stöchiometrie. Protein- Liganden Docking wurde durchgeführt, um potenzielle Bindestellen für RFamid II am Heterotrimer vorherzusagen. Aminosäuren, die hierbei als Kandidaten für die Bindestelle an der Daumen-Domäne von HyNaC3 auffielen, wurden basierend auf vorherigen funktionellen Ergebnissen des Gründer-Labors ausgesucht und wurden für UV-induziertes Photo- Crosslinking verwendet. Mithilfe verschiedener Antikörper wie α-FMRFamid, α-RFamid, und einem affinitätsaufgereinigten α-RFamide II Antikörper, welche erfolgreiches Crosslinking über den Peptidliganden nachweisen sollten, konnten wir kein spezifisches Signal nachweisen, welches auf kovalent gebundene RFamid-HyNaC-Komplexe hindeutete. Modifizierung von RFamid II mit Biotin oder einem flag-tag an verschiedenen Aminosäurepositionen erzeugte stark verringerte apparente Affinität, weshalb wir nachfolgend einen Alanin-Scan des Peptids durchführten. Der Scan zeigte eine starke Verringerung der apparenten Affinität für jede Aminosäure des Peptids, außer für Position 5 (Glyzin). Photo-crosslinking mithilfe von biotinylierten Peptiden führte ebenfalls zu keinem spezifisch detektierbaren Crosslinking-Signal auf Western Blots. Schließlich nutzten wir den affinitätsaufgereinigten α-RFamide II Antikörper mit einer RFamid II Variante, welche ein N- terminales Cystein statt des Pyroglutamats trug und für die Kopplung an einen Carrier während der Antikörpersynthese genutzt wurde. Auch hier war die Visualisierung eines RFamid II-HyNaC-Komplexes auf einem Western Blot nicht möglich. Die Identifikation der Bindestelle von RFamiden an HyNaCs könnte dazu beitragen, das Grundverständnis phylogenetischer und evolutionärer Verwandtschaft zwischen DEG/ENaC Proteinen zu vertiefen und weiterhin dabei helfen, diese Erkenntnisse von einfachen Nervensystemen auf konservierte Merkmale ebensolcher Kanäle in komplexeren Tieren zu übertragen. Zukünftige Experimente werden das radioaktive Labelling von RFamid II nutzen, um weitere Einsicht in eine mögliche Bindestelle des Liganden an der Daumendomäne von HyNaC3 zu gewinnen.

Einrichtungen

• Fachgruppe Biologie [160000]
• Lehrstuhl für Chemosensorik [163310]