Identification and functional characterization of binding partners and substrates of viral macrodomains with a focus on Chikungunya virus

Krieg, Sarah; Lüscher, Bernhard (Thesis advisor); Huber, Michael (Thesis advisor)

Aachen : RWTH Aachen University (2022)
Doktorarbeit

Dissertation, RWTH Aachen University, 2022

Kurzfassung

Einzelsträngige RNA Viren mit positiver Polarität ((+)ssRNA) stellen, aufgrund ihrer hohen Mutationsraten und Anpassungsfähigkeit, eine substanzielle gesundheitliche Bedrohung dar. Daher werde fortwährend neue therapeutische Angriffspunkte gesucht um Resistenzen entgegenzuwirken. Ein Teil dieser (+)ssRNA Viren kodiert für sogenannte Makrodomänen (Makros). Diese sind charakterisiert durch eine konservierte Domänenarchitektur, die stark mit ADP-Ribosylierung assoziiert ist. ADP-Ribosylierung umfasst eine posttranslationale Proteinmodifikation, die aus einer einzelnen ADP-Ribose (ADPr) Einheit oder aus einem ADPr-Polymer bestehen kann. Diese Varianten werden jeweils als Mono- und Poly-ADP-Ribosylierung (alias MARylierung und PARylierung) bezeichnet. Neben Proteinen wurden kürzlich auch DNA und RNA als Substrate für ADP-Ribosylierung identifiziert. Intrazellulär ist hauptsächlich die Familie der Diphtheriatoxin-verwandten ADP-Ribosyltransferasen (ARTDs alias PARPs) für diese Modifikationen verantwortlich. Die meisten ARTDs katalysieren MARylierung und von diesen sind einige, z.B. ARTD10, Interferon(IFN)-induzierbar. Dies impliziert eine Rolle in der angeborenen Immunantwort. Im Zuge dieser Arbeit, wurden die viralen Makros von vier Alphaviren, zwei Ortho-Hepeviren und einem Alphacoronavirus in vitro als effiziente Hydrolasen für MARylierung von verschieden Proteinen identifiziert. Dagegen konnte gezeigt werden, dass die Aktivität gegenüber PARylierung ineffizient ist. Im Weiteren wurde eine detailliertere Charakterisierung der Makro von Chikungunya Virus (CHIKV) durchgeführt. CHIKV ist ein Alphavirus, der sich ausbreitet und weltweit bereits Millionen Menschen infiziert hat. Neben einer akuten, Grippe-ähnlichen Phase, entwickelt sich eine Erkrankung in ca. 30% der Fälle zu einer chronischen Arthralgie. In der CHIKV Makro wurden katalytisch relevante Aminosäuren identifiziert. Die MAR-Hydrolaseaktivität konnte sowohl für das Volllänge Nichtstruktur-protein 3 (nsP3), welches die Makro enthält, als auch in Zellen bestätigt werden. Im Weiteren wurde die mechanistische Relevanz der MAR-Hydrolaseaktivität der CHIKV Makro sowie die der MARylierung durch IFN-induzierbare ARTDs detaillierter untersucht. Dazu wurde ein RNA Replicon-basiertes System genutzt, in dem Gaussia Luciferase als Maßstab für CHIKV-Replikation verwendet wurde. Mit diesem System konnte ARTD10, abhängig von seiner katalytischen Aktivität, als Restriktionsfaktor für CHIKV identifiziert werden. Außerdem konnte gezeigt werden, dass die Interaktion der viralen Makro mit MARylierung essentiell für die Replikation ist. Diese Effekte konnten, zumindest partiell, auf Defekte in der proteolytischen Spaltung des Nichtstrukturpolyproteins zurückgeführt werden. Die virale Protease binnen nsP2 ist für diese essentielle Proteolyse verantwortlich. NsP2 wurde als Substrate von ARTD10-vermittleter MARylierung in vitro und in Zellen identifiziert. Diese MARylierung inhibiert die Proteaseaktivität in vitro, während Hydrolyse durch die CHIKV Makro diesen Effekt aufheben kann. Darüber hinaus wurden Experimente durchgeführt um Wirtsfaktoren zu identifizieren, die durch MARylierung reguliert werden. Hierfür wurden das BioID-System sowie klassische Pulldown-Assays mit nsP3, der isolierten Makro und ARTD10 durchgeführt, um gemeinsame Interaktoren mittels Massenspektrometrie zu identifizieren. Für ARTD10 wurde außerdem der Einfluss von IFN und katalytischer Aktivität auf das Interaktom untersucht. Es wurden sowohl neue als auch bekannte Interaktoren von nsP3 bestätigt und G3BP1 (Ras GTPase-activating protein-binding protein 1) wurde als Substrat von (De-)MARylierung in vitro identifiziert, mit potenzieller Relevanz für CHIKV Infektionen.

Einrichtungen

• Fachgruppe Biologie [160000]
• [513000-2]