The role of Dlk1 in the gene regulatory network underlying motor neuron diversification

Wasser, Yasmine; Marquardt, Till (Thesis advisor); Zimmer-Bensch, Geraldine Marion (Thesis advisor)

Aachen : RWTH Aachen University (2022)
Doktorarbeit

Dissertation, RWTH Aachen University, 2022

Kurzfassung

Delta-like homologue 1 (Dlk1) wurde als molekularer Determinant in der Funktionsvielfalt der Motoneuronen etabliert. Vorrangegangene elektrophysiologische Studien an Maus- und Hühnerembryonen zeigten eine Dlk1-abhängige Genexpression während der Motoneuronenentwicklung für einen funktionellen Motorneuron Subtypen. Diese Dlk1 abhängige Genexpression führt zu einem zellulären Phänotyp, der die Eigenschaften von schnellen Alpha Motoneuronen aufweist. Vorangegangene Experimente zu Dlk1-Interaktionspartnern und zur Stimulation des Dlk1-Signalwegs reichten nicht aus, um den Signalweg aufzuklären. Diese Arbeit untersucht den Dlk1-abhängigen Mechanismus, der dazu führt, dass Motorneuronen die Eigenschaften der schnellen Alpha Motoneuron aufweisen. Daher wurde die Hypoxie-abhängige Dlk1-Regulation in Bezug auf die Diversifizierung von Motoneuronen während der Embryogenese untersucht. Zunächst wurden 12.5 Tage alte Embryonen (E12.5) im Hinblick auf die Expression von Dlk1 im Zusammenhang mit geringeren Sauerstoffbedingungen analysiert. Unterschiedliche Sauerstoffkonzentrationen können einen großen Einfluss auf die Embryogenese haben. Daher lag die Vermutung nahe, dass die Wechselwirkungen zu Interaktionspartnern durch eine niedrige Sauerstoffkonzentration beeinflusst werden kann. Da jedoch keine aussagekräftigen Unterschiede in der Hypoxie abhängigen Proteinantwort im Rückenmark des Embryos festgestellt werden konnten, wurde der Fokus auf die Entwicklung der Motoneuronen in vitro beschränkt. Um die Entwicklung von Motorneuronen zu analysieren wurden embryonale Stammzellen bis zu einem Zustand von ausgewachsenen Motoneuronen differenziert und anschließend analysiert. Bei diesem Ansatz konnte, durch einen hypoxischen Stimulus, die Abnahme der Proteinmenge von Dlk1 beobachtet werden. Um jedoch auszuschließen, dass es sich bei diesem Effekt um ein Artefakt der Zellkultur handelt, wurde die Prozessierung des Dlk1 Proteins ebenfalls in murinen Hirnschnitten untersucht. Mit diesem zusätzlichen Ansatz war es möglich, die Hypoxie-abhängigen Proteinänderungen im Vergleich zu vorangegangenen Experimenten in Motoneuronen zu verifizieren. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass die Abnahme der Proteinmenge von Dlk1 nach einem hypoxischen Stimulus unabhängig vom Alter und Geschlecht der Mäuse ist. Um die Abnahme der Proteinmenge von Dlk1 nach Hypoxie zu klären, wurde eine modifizierte embryonale Stammzelllinie genutzt. Diese hat den Vorteil, einen zusätzlichen HA-Tag am C-terminalen Ende zu haben. Dlk1 wird nach hypoxischer Stimulation in eine extrazelluläre Domaine und ein intrazelluläres Fragment gespalten. Basierend auf dieser Tatsache, konnte gezeigt werde, dass eine der Spaltungen durch die TACE/Adam17-Protease vermittelt wird. Ausgehend von der Spaltung konnte auch das intrazelluläre Fragment und seine Translokation in den Zellkern beobachtet werden. Insgesamt konnte gezeigt werden, dass ein externe hypoxische Stimulation zu einer Spaltung von Dlk1 in ein extrazelluläres und intrazelluläres Fragment führt. Das intrazelluläre Fragment wurde weiter in den Zellkern transloziert, wo es möglicherweise transkriptionelle Co-Faktor-ähnliche Aktivitäten hat. Ausgehend von diesen Daten wird weiter untersucht, ob die Mmp9 Gene Regulierung mit dem Dlk1-abhängigen Prozess der Krebszellregulierung, wie z. B. der Reorganisation der extrazellulären Matrix, in Zusammenhang stehen könnte. Demnach könnte Dlk1 an der durch hypoxische Stimulus vermittelten Mmp9-Sekretion beteiligt sein.

Einrichtungen

• Fachgruppe Biologie [160000]
• Lehrstuhl für Neurobiologische Forschung [164310]