Development and establishment of photoswitchable systems on the surface of plant virus particles

• Entwicklung und Etablierung von lichtkontrollierbaren Systemen auf der Oberfläche von pflanzlichen Viruspartikeln

Kauth, Louisa; van Dongen, Joost Thomas (Thesis advisor); Prüfer, Dirk (Thesis advisor)

Aachen : RWTH Aachen University (2022)
Dissertation / PhD Thesis

Dissertation, RWTH Aachen University, 2022

Abstract

Lichtkontrollierbare Proteine interagieren bei Lichtanregung reversibel und gewinnen in der Biomedizin und Biomaterialwissenschaft zunehmendes Interesse. Licht repräsentiert einen effektiven Stimulus, der einfach regulierbar und mit hoher zeitlicher und räumlicher Kontrolle anwendbar ist. Die Pflanzenviren Kartoffelvirus X (PVX) und Tabakmosaikvirus (TMV) sind häufig genutzte Partikel zur Präsentation heterologer Proteine. Die Verwendung pflanzlicher Viruspartikel zeigte bereits vielversprechende Ergebnisse in biomedizinischen Anwendungen wie der bevorzugten Akkumulation in Tumorgewebe. Die Präsentation lichtkontrollierbarer Systeme auf der viralen Nanopartikeloberfläche schafft die Möglichkeit zur Entwicklung von Freisetzungssystemen. Es wurden die optogenetischen Proteinsysteme LOVTRAP, Dronpa145N und BphP1/QPAS1 ausgewählt, die den Bereich von violettem bis infrarotem Licht durch unterschiedliche Anregungs- und Reversionswellenlängen abdecken. Die in-vitro-Funktionalität der Systeme wurde mittels nativer PAGE bestätigt. Für das LOVTRAP- und BphP1/QPAS1-System konnte eine Verlagerung des Signals für den Komplex bei Bestrahlung mit der Anregungswellenlänge gezeigt werden. Der Wechsel zwischen der monomeren und tetrameren Form von Dronpa145N wurde ebenfalls bestätigt. Die Proteine wurden mittels SpyTag/SpyCatcher (ST/SC) auf der Virusoberfläche präsentiert. Die erfolgreiche Kopplung der Proteine an das Hüllprotein wurde über SDS-PAGE und Western Blot gezeigt. Kopplungseffizienzen für PVX von bis zu 63% und für TMV von bis zu 54% wurden erreicht, was mit Literaturwerten übereinstimmt. Die Golddekoration der Partikel unter dem Transmissionselektronenmikroskop (TEM) bestätigte die Modifikation der Nanopartikel mit den SC-Proteinen. Die Anlagerung des Proteinpartners an die modifizierten Viruspartikel bei Bestrahlung mit der Anregungswellenlänge und die Golddekoration der Viruspartikel im TEM durch Nachweis des Partners auf der Oberfläche bestätigten die Proteinbindung. Diese Markierung zeigte sich nicht bei Bestrahlung mit der Reversionswellenlänge. Bei TMV konnte keine Partikelbeladung mit dem LOVTRAP-System erreicht werden, was möglicherweise auf die starre Komposition des Virus zurückzuführen ist, die eine sterische Hinderung der Proteinbindung zur Folge hat. Die Ergebnisse bestätigen die Funktionalität von lichtkontrollierbaren Proteinen auf der Oberfläche der PVX-Nanopartikel. Insbesondere das BphP1/QPAS1 System im roten Lichtbereich ist von großem Interesse, da längere Wellenlängen eine tiefere Gewebeeindringung ermöglichen. Größenbeschränkungen, die bei BphP1 auftreten können, werden bei den Systemen LOVTRAP und Dronpa145N durch eine geringere Proteingröße umgangen. Somit bietet jedes System einzigartige Vorteile für spätere Anwendungen. Die vorliegende Studie bestätigt die Entwicklung eines neuen Freisetzungssystems auf Basis der lichtkontrollierbaren Systeme LOVTRAP, BphP1/QPAS1 und Dronpa145N. Damit bilden die Ergebnisse die Grundlage für die Etablierung neuartiger, auf Nanopartikeln basierender, kontrollierbarer Freisetzungssysteme.