Characterization and optimization of 1-hexanol production in CO-utilizing clostridia

Kottenhahn, Patrick; Blank, Lars M. (Thesis advisor); Büchs, Jochen (Thesis advisor)

Aachen : RWTH Aachen University (2022)
Doktorarbeit

Dissertation, RWTH Aachen University, 2022

Kurzfassung

Ziel dieser Arbeit ist die Optimierung von Hexanolproduktion aus Syngas. Hexanol kann z.B. zu Kunst-,Treib- oder Zusatzstoffen verarbeitet werden. Zwei potenzielle Biokatalsyatoren, C. carboxidivorans und C. ljungdahlii wurden charakterisiert und für diese Anwendung bewertet. Im Folgenden sind die wichtigsten Ergebnisse zusammengefasst: Die Betrachtung der Bioenergetik des Stoffwechselweges zeigten die Möglichkeit von Hexanolproduktion ohne Nebenprodukte. Die Toxizitätvon Hexanol wurde als ein limitierender Faktor identifiziert und konnte durch Extraktion umgangen werden. Dies steigerte die Produktion um den Faktor ~2.5 auf 24 mM Hexanol. Beide Bakterienarten zeigten ähnliche Hexanoltoleranz mit akuter Inhibierung bei ≤ 20 mM. Bei 30°C war die Hexanoltoleranz von C. carboxidivorans (IC50 17.5 mM) höher als bei 37°C (IC50 11.8 mM). Für die Maßstabsvergrößerung von Flaschen zum Rührkesselreaktor wurden die Gasbereitstellung, gemessen als relative gelöst-CO Konzentration, und unterschiedliche Nährstoffanforderungen als wichtigste Faktoren erkannt. Der höchste hierbei produzierte Hexanoltiter von 37 mM ist ca. dreimal so hoch wie die höchste in anderen Studien berichtete Ausbeute. Um die heterologe Hexanolproduktion mit C. ljungdahlii zu optimieren, wurden alternative Hexanolproduktionsenzyme in transgenen C. ljungdahlii Stämmen verglichen. Die erreichten Ausbeuten blieben jedoch unter denen von C. carboxidivorans. Nur nach Hitzeschock des Empfängers oder durch Expression der Methyltransferasen von C. carboxidivorans im Donorstamm wurden in Konjugationsversuchen mit C. carboxidivorans Kolonien erhalten. Diese wuchsen in Gegenwart der zur Selektion gewählten Antibiotika, verifizierbare Flüssigkulturen wurden jedoch nichterhalten. Das Methylierungsmuster von C. carboxidivorans wurde untersucht und die identifizierten Motive wurden den jeweiligen Enzymen zugeordnet. Konvertergas (KG) wurde mit synthetischem KG verglichen, um die Wirkung inhibierender Komponenten zu ermitteln. Ohne Verdünnung des Gases wurde bei niedrigen Zelldichten kein Wachstum beobachtet. Dies konnte mit hohen Zelldichtenteilweise umgangen werden. Finale Produkt- und Wachstumsausbeuten waren jedoch bei beiden Gasen vergleichbar. Wurde die Gasphase erneuert, stoppte das Wachstum auch bei hohen Zelldichten, eine Adaptation auf das Gas wurde nicht beobachtet. Im Vergleich zu synthetischem KG waren Wachstums-und Produktausbeuten mit H2+CO2 reduziert. Niedriger pH und die Zugabe von 2 g L-1 Carbonat zum Medium führten zu höheren Hexanoltitern. C. carboxidivorans stellt somit einen vielversprechenden Ausgangsstamm für die Hexanolproduktionaus Syngas dar. Die in dieser Studie erreichten Titer von 37 mM (3.8 g L-1) Hexanol sind höher als alle bisher publizierten Werte mit biologischen Alternativen. Aktuell fehlt für C. carboxidivorans jedoch eingenetisches System. Wenn die in dieser Arbeit identifizierten Fragestellungen adressiert werden, kann die Hexanolproduktion aus Syngas potenziell zu einem kommerziell erfolgreichen Prozess entwickeltwerden, um Kohlenstoffemissionen zu senken und die gesellschaftliche Abhängigkeit von fossilen Kohlenstoffquellen zu reduzieren.