Accelerated production and screening of catalytically active inclusion body libraries via automated workflows

Küsters, Kira; Oldiges, Marco (Thesis advisor); Schwaneberg, Ulrich (Thesis advisor); Wiechert, Wolfgang (Thesis advisor)

Aachen : RWTH Aachen University (2022)
Doktorarbeit

Dissertation, RWTH Aachen University, 2022

Kurzfassung

In den letzten Jahren wurde die Produktion von inclusion bodies nachgewiesen, die eine erhebliche katalytische Aktivität aufweisen. Diese katalytisch aktiven inclusion bodies (CatIBs) wurden durch genetische Fusion eines aggregationsinduzierenden Tags mit dem gewünschten Gen über kurze Linker-Polypeptide und anschließender Überproduktion der resultierenden Genfusion in Escherichia coli gebildet. Die resultierenden CatIBs sind bekannt für ihre einfache und kostengünstige Produktion, ihre Wiederverwertbarkeit sowie ihre hohe Stabilität und stellen eine Alternative als rein biologische Technologie für die Enzymimmobilisierung dar. Aufgrund ihrer Fähigkeit zur Selbstaggregation in einer trägerfreien, biologisch abbaubaren Form sind keine weiteren aufwendigen Immobilisierungsschritte oder zusätzliche Materialien erforderlich. Diese positiven Eigenschaften verschaffen CatIBs eine vorteilhafte Position im Vergleich zu herkömmlichen Immobilisierungstechniken. Jüngste Studien haben die Auswirkungen der kooperativen Effekte des Linkers und des aggregationsauslösenden Tags auf das Aktivitätsniveau von CatIBs gezeigt. Es ist bisher jedoch nicht möglich, eine Vorhersage über die beste Kombination von Linker und aggregationsauslösendem Tag zu treffen. Daher müssen viele Varianten getestet werden, um die besten CatIBs zu finden. Dafür muss die ganze CatIB-Prozessierung, von der Konstruktion bis zur Analyse, beschleunigt werden, um ein schnelles Screening von CatIB Bibliotheken zu ermöglichen. In einer Proof-of-Concept-Studie wurde eine Reihe von Lysindecarboxylase-CatIBs aus E. coli (EcLDCc) mittels Golden Gate Assembly generiert und mit einem optimierten Aufreinigungsprotokoll verarbeitet, das im späteren Verlauf eine Automatisierung des Prozesses ermöglicht. Insgesamt wurden zehn EcLDCc-Varianten generiert, die aus Kombinationen von zwei Linker- und fünf aggregationsinduzierenden Tag-Sequenzen bestehen. Ein flexibler Serin/Glycin (SG)- sowie ein starrer Prolin/Threonin (PT)-Linker wurden in Kombination mit den Peptiden (18AWT, L6KD und GFIL8) oder den Coiled-Coil-Domänen (TDoT und 3HAMP) als aggregationsinduzierende Tags getestet. Interessanterweise zeigten die meisten Kombinationen mit dem starren PT-Linker die höchsten Aktivitäten. EcLDCc-PT-L6KD wurde als die beste Varianten identifiziert, die eine spezifische volumetrische Produktivität von 256 gDAP L-1 d-1 gCatIB 1 ermöglicht. Zudem konnte gezeigt werden, dass die mikroskopische Analyse als Werkzeug zum Auffinden von CatIB-produzierenden Stämmen dienen kann und somit ein Vorscreening in einem frühen Stadium ermöglicht, um Zeit und Ressourcen zu sparen. Um den Mikroskopieprozess zu beschleunigen, wurde ein automatisierter Mikroskopie-Workflow implementiert und zur Beobachtung der CatIB-Bildung eingesetzt. Die sowohl manuell als auch automatisiert ausgewerteten Ergebnisse zeigten, dass die Bildung der CatIBs nach 27 Stunden einsetzte. Nach der Proof-of-Concept-Studie mit dem EcLDCc wurde ein semi-automatischer Klonierungs-Workflow implementiert, um eine schnelle Konstruktion von CatIB-Bibliotheken mit einer Zeitersparnis von 83 % zu ermöglichen, so dass nur 11 Stunden manuelle Arbeit für die Konstruktion von 96 CatIB-Varianten erforderlich waren. Der Klonierungs-Workflow wurde verwendet, um 14 CgAHAS (Acetolactat-Synthase von Corynebacterium glutamicum)-, 60 LbADH (Alkohol-Dehydrogenase von Lactobacillus brevis)-, 63 BsGDH (Glucose-Dehydrogenase von Bacillus subtilis)- und 30 BmMO (Monooxygenase von Bacillus megaterium)-CatIB-Variantenbibliotheken erfolgreich zu erzeugen. Um die konstruierten CatIB-Varianten parallel zu testen, war eine Beschleunigung der manuellen CatIB-Analyse erforderlich. Daher wurde eine Miniaturisierung der Kultivierung und der CatIB-Aufreinigung von einem 10 mL Schüttelkolben auf einen 1 mL FlowerPlate® Maßstab angewendet. Außerdem wurde der enzymatische Assay in einer Mikrotiterplatte (250 µL) anstelle von Reaktionsgefäßen (1 mL) durchgeführt. Der beschleunigte Arbeitsablauf wurde für das Screening der CgAHAS- und LbADH-CatIB-Bibliotheken verwendet, wobei 2 von 14 (CgAHAS) und 8 von 60 (LbADH) erfolgreiche CatIB-Kandidaten gefunden wurden. Nach der Prozessbeschleunigung bestand der nächste Schritt darin, den CatIB-Screening-Workflow zu automatisieren. Der erste Schritt war die Implementierung eines robusten manuellen Arbeitsablaufs, der anschließend auf eine Roboterplattform übertragen wurde. Dafür wurden 14 C-terminal angehängte BsGDH-Varianten generiert und in einem manuellen Ansatz analysiert. Ähnlich wie in der EcLDC-Studie wurden SG- oder PT-Linker mit einem von acht aggregationsinduzierenden Tags kombiniert. Neben den fünf getesteten aggregationsinduzierenden Tags, 18AWT, L6KD, GFIL8, TDoT und 3HAMP, wurde zusätzlich der Einfluss von ELK16, TorA und CBDCell auf die CatIB-Aktivität analysiert. Der enzymatische Assay zeigte, dass die höchsten Umsätze wieder mit PT-Linker-Varianten erreicht wurden. Die vielversprechendste Variante war BsGDH-PT-CBDCell mit einer spezifischen volumetrischen Produktivität von 55,8 gNADH L-1 d-1 gCatIB-1. Diese Variante wurde zudem genauer charakterisiert, einschließlich der Langzeitlagerung bei 20 °C sowie der NADH-Cofaktor-Regenerationsleistung in wiederholten Batch-Experimenten in Kombination mit CatIB-Recycling. Nach dem Einfrieren verloren BsGDH-PT-CBDCell CatIBs nach 8 Wochen Lagerung nur ca. 10 % ihrer Aktivität. Außerdem waren nach 11 CatIB-Recyclingzyklen im repetitiven Batch-Betrieb noch 80 % der Aktivität vorhanden. Mit den BsGDH-CatIBs wurde nicht nur das NADH-Recycling analysiert, sondern auch das NADPH-Recycling. BmMO-CatIBs als NADPH-Verbraucher wurden konstruiert und zum Nachweis der NADPH-Recyclingfähigkeit von BsGDH verwendet. 13 von 30 BmMO-CatIBs zeigten Aktivität in Kombination mit NADPH-Recycling. Nach der Durchführung des manuellen Screenings wurde BsGDH-PT-CBDCell zur Implementierung, Optimierung und Validierung des automatisierten CatIB-Screening-Workflows verwendet, um die Analyse mehrerer CatIB-Kandidaten zu verbessern. Wichtige Optimierungsschritte waren z.B. der Ausschluss eines Positionseffekts im BioLector® durch Erhöhung der Kultivierungstemperatur auf 25 °C und die Sicherstellung der Pipettierreproduzierbarkeit durch Verbesserung der Pipettiereinstellungen wie Geschwindigkeit, Mischen, Luftblasen und Höhe. Die Validierung des optimierten Arbeitsablaufs mit einer relativen Standardabweichung von 1,9 % ergab eine hohe Reproduzierbarkeit. Nach der Validierung wurde der Arbeitsablauf in Kombination mit dem Thompson Sampling als Entscheidungshilfe für die Stammauswahl durchgeführt, um 63 BsGDH-CatIB-Varianten zu analysieren. Es wurden drei Durchgänge mit jeweils 48 Kultivierungen parallel durchgeführt. Die Screenings zeigten, dass 24 von 63 BsGDH-CatIB-Varianten erfolgreich waren. Bereits in der ersten Screening-Runde erwies sich TDoT-PT-BsGDH als vielversprechender CatIB-Kandidat, so dass die Wahrscheinlichkeit hoch war, dass es sich um die beste BsGDH-CatIB-Performance handelt. Daher hat der Thompson-Sampling-Algorithmus diese Variante in 50 biologischen Replikaten während der drei Screening-Runden ausgewählt. Mit dem implementierten halbautomatischen CatIB-Konstruktions-, Aufreinigungs- und Screening-Workflow konnte die manuelle Arbeitszeit von 59 Stunden auf 7 Stunden für 48 Varianten (-88 %) reduziert werden. Zudem wurde eine Hochskalierung als Schüttelkolbenkultivierung der drei besten BsGDH-CatIB-Varianten als Validierungsstudie für das Thompson-Sampling durchgeführt, die sehr ähnliche Ergebnisse wie die FlowerPlate®-Kultivierung zeigte. Diese Ergebnisse zeigten, dass das Thompson-Sampling für das BsGDH-Screening erfolgreich war. Obwohl die Analyse aller CatIB-Enzyme ergab, dass z. B. der PT-Linker im Vergleich zum SG-Linker mit größerer Wahrscheinlichkeit erfolgreiche CatIB-Varianten bildet, ist dennoch keine Vorhersage a priori möglich, da jedes Enzym andere Linker/Aggregations-induzierende Tag-Kombinationen für höchste Leistung benötigt. Daher ist die Verwendung des automatisierten Arbeitsablaufs ein wichtiges Werkzeug zur Verbesserung und Vereinfachung des Screenings, um den besten CatIB-Produzenten aus großen CatIB-Bibliotheken zu finden.