Biocatalytic reduction of carboxylic acids : production and application of carboxylate reductases in synthetic enzyme cascades

Weber, Douglas; Rother, Dörte (Thesis advisor); Lauterbach, Lars (Thesis advisor); Jupke, Andreas (Thesis advisor)

Aachen : RWTH Aachen University (2022)
Doktorarbeit

Dissertation, RWTH Aachen University, 2022

Kurzfassung

Die Tetrahydroisochinolin (THIQ)-Einheit ist ein "privilegiertes Gerüst", das in zahlreichen bioaktiven Naturstoffen vorkommt. THIQ-haltige Verbindungen weisen verschiedene bioaktive Eigenschaften auf und werden daher für pharmazeutische Anwendungen genutzt. Chemische Synthesen dieser Verbindungen sind zwar möglich, führen aber selten zu hohen Stereoselektivitäten. Außerdem werden oft giftiger oder umweltschädlicher Chemikalien zur Synthese benötigt. Daher sind neue synthetische Ansätze zu THIQ von großem Interesse. Die in-vitro und in-vivo Biokatalyse bietet passende Methoden zur Herstellung komplexer THIQs mit hoher Stereoselektivität und unter milden Bedingungen. So wurde beispielsweise bereits eine dreistufige (chemo)enzymatische Kaskade zu einem 1,3,4-trisubstituierten THIQ etabliert. Bei diesem Ansatz dient kommerziell erhältliches 3-Hydroxybenzaldehyd (3-OH-BA) als Ausgangsmaterial. Dieses Aldehyd ist recht preiswert ist, wird aber hauptsächlich aus Erdölressourcen gewonnen. Im Sinne einer nachhaltigen und wirtschaftlich wettbewerbsfähigen Bioökonomie sind alternative Ansätze unter Einsatz nachwachsender Rohstoffe anzustreben. Daher wird in dieser Arbeit eine vierstufige enzymatische Kaskade zum anvisierten trisubstituierten THIQ vorgeschlagen, die mit 3-Hydroxybenzoesäure beginnt (die letztlich von mikrobiellen Zellfabriken aus erneuerbaren Ressourcen wie Glykose und/oder Xylose gewonnen werden kann). Das Neue an dieser Kaskade ist die Reduktion von 3-Hydroxybenzoesäure (3-OH-BZ) zu 3-OH-BA durch eine Carboxylatreduktase (CAR). In diesem Schritt ist die Implementierung eines effizienten Kofaktor- Regenerierungsystems von ATP und NAD(P)H entscheidend. Zu diesem Zweck wurden ein in-vitro Cofaktor- Regenerierung-Ansatz, bei dem nur gereinigte Enzyme verwendet wurden, und ein Ganzzell-Ansatz, entwickelt und verglichen. Beide Ansätze erwiesen sich als vielversprechend, und es wurden hohe Umsätze der Säure in 3-OH-BA erzielt (>80%). Das Ganzzellsystem war jedoch überlegen, da es (i) die Kombination des ersten und des zweiten Schritts der Kaskade in einem Eintopfsystem mit ausgezeichneten Produktausbeuten (>99%, ee≥95%) zum Zwischenprodukt 3-Hydroxyphenylacetylcarbinol (3-OH-PAC) ermöglichte und (ii) die Substrattoleranz der Zellen im Vergleich zu dem System, bei dem nur gereinigte Enzyme eingesetzt wurden, verbesserte. Der dritte und vierte Schritt der Kaskade wurden aufgrund von Kreuzreaktivitäten und der damit verbundenen Bildung mehrerer Nebenprodukte sequentiell durchgeführt. (1R,2S)-Metaraminol konnte mit guten Umsätzen (>90%, ic ≥95%) gebildet werden, wobei entweder gereinigte oder Ganzzell-Amin-Transaminase aus Bacillus megaterium (BmTA) oder Chromobacterium violaceum (Cv2025) verwendet wurde. Der Zyklisierungsschritt wurde durch eine Variante der Norcoclaurin-Synthase aus Thalictrum flavum (ΔTfNCS-A79I) katalysiert, was zur Bildung des 1,3,4-trisubstituierten THIQ-Produkts mit hohen Produktausbeuten (>90%, ic>90%) führte. Die Gesamtproduktausbeute der in-vitro und in-vivo Kaskaden betrug 72 bzw. 87%, mit ähnlichen ee- und ic-Werten. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Anwendbarkeit enzymatischer Kaskaden für die Bildung einer komplexen chiralen Verbindung mit drei chiralen Zentren aus kostengünstigen erneuerbaren Ausgangsstoffen nachgewiesen werden konnte. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass einige Schritte auf andere aromatische Ausgangsstoffe übertragbar sind.