Accelerated metabolomics for bioprocess development

Reiter, Alexander Marc Christopher; Oldiges, Marco (Thesis advisor); Blank, Lars M. (Thesis advisor); Wiechert, Wolfgang (Thesis advisor)

Aachen : RWTH Aachen University (2022)
Doktorarbeit

Dissertation, RWTH Aachen University, 2022

Kurzfassung

Die mikrobielle Phänotypisierung und die Entwicklung von Bioprozessen wurden durch den Einsatz von hochgradig parallelisierten Kultivierungsplattformen in kleinem Maßstab erheblich beschleunigt, was zu einem Engpass bei der bioanalytischen Analyse von Bioprozessen führt. Während kleinskalige Kultivierungsplattformen die Bestimmung typischer Prozessparameter ermöglichen, werden ohne umfassende Analytik nur limitierte Informationen über die Bildung von Produkten und Nebenprodukten bereitgestellt. Die Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie kann zwar einen solchen umfassenden Einblick bereitstellen, ist jedoch häufig durch die Analysenzeit limitiert. Für einen quantitativen, gezielten Ansatz wurden in dieser Studie sechs Methoden zur Quantifizierung von Aminosäuren entwickelt, wobei zwei starke Kationenaustauscher-Säulen und ein Dilute-and-Shoot Flow-Injection-Analysis Verfahren (DS-FIA-MS/MS) in Verbindung mit einem Triple-Quadrupol- und einem Quadrupol-Flugzeit-Massenspektrometer verwendet wurden. Zur Berücksichtigung von Matrixeffekten wurde die Isotopenverdünnungs-Massenspektrometrie mit 13C15N-markierten Aminosäuren eingesetzt. Eine ausführliche Methodenvalidierung bestätigt die Vielseitigkeit der Methoden für die Erstellung von Metabolit-Profilen von mikrobiellen Kulturüberständen. Für einzelne Analyten zeigten die Methoden mit Chromatographie einen linearen Bereich von etwa 4 Größenordnungen, ausreichende Response-Faktoren und niedrige Quantifizierungsgrenzen (7 - 443 nM). Insgesamt war die relative Standardabweichung für alle Analyten vergleichbar, mit 8 % und 11 % für ungepufferte bzw. gepufferte Medien. Die DS-FIA-MS/MS-Methoden mit einer Analysezeit von 1 Minute pro Probe boten eine vergleichbare Leistung, jedoch einen bis zu 35-mal höheren Durchsatz. Metabolic footprinting ist ein ganzheitlicher Ansatz zur Erfassung weitreichender metabolischer Informationen eines biologischen Systems und ist damit eine treibende Kraft in der Systembiologie und Bioprozessentwicklung. Für einen teils-gezielten Ansatz wurde ein automatisierter Arbeitsablauf etabliert, um relevante Metabolit-Informationen aus einem organismus-spezifischen Genommodell bereitzustellen und folgend eine umfassende Analysemethode zu entwickeln. Der abgeleitete Metabolitensatz basierend auf firmeneigenen, literarischen und vorhergesagten Metabolitendaten wurde dazu in Methoden für die DS-FIA-MS/MS aufgeteilt. Der Arbeitsablauf wurde verwendet, um eine Methode für Saccharomyces cerevisiae zu entwickeln, welche die Analyse von 252 Metaboliten in 7 Minuten pro Probe ermöglicht. Die Methode wurde mit einem kommerziell erhältlichen Hefemetabolom-Standard validiert und erlaubte die Identifizierung von 74,2 % der annotierten Metabolite. In einer ersten Fallstudie wurden drei handelsübliche Hefeextrakte untersucht, wobei 118 Metaboliten die Qualitätskontrollschwellen für die statistische Analyse erreichten, was die Identifizierung von charakteristischen Metaboliten ermöglichte. Die vorgestellte Methode erlaubt ein zeiteffizientes Metabolit-Screening durch Skalierung der Analysezeit mit der Anzahl an Metaboliten und ist an andere mikrobielle Systeme anpassbar. Corynebacterium glutamicum (C. glutamicum) ist ein industrieller Plattformorganismus für die Produktion von Aminosäuren. In der Vergangenheit wurde der Organismus zur Herstellung von L-Histidin verwendet, wobei sich die Forschung auf Methoden des Metabolic Engineering konzentrierte. In diesem Bereich wurden nur wenige Studien veröffentlicht, die Aufschluss über die Bioprozessentwicklung geben, wobei die Medienoptimierung und die Fed-Batch-Kultivierungsverfahren besonders vielversprechende Bereiche darstellen. Zur Bewertung der DS-FIA-MS/MS Methoden wurde die Bioprozessentwicklung einer L-Histidin produzierenden C. glutamicum-Mutante durchgeführt. Dabei wurde der gezielte DS-FIA-MS/MS-Ansatz für ein umfassendes Stammscreening in einer parallelisierten und automatisierten Kultivierungsplattform von 96 L-Histidin-produzierenden, zufällig mutierten C. glutamicum-Stämmen verwendet, um die vielversprechendsten Produzenten für eine anschließende Optimierung zu identifizieren. Im Rahmen der Medienoptimierung ergaben sich Medienlimitierungen in Form von Phosphat und Magnesium als Optimierungsziele für den Prozess im Labormaßstab. Der Prozess wurde in den Labormaßstab übertragen und anschließend durch Anreicherung des Mediums und Feed in einem Fed-Batch-Kultivierungsverfahren optimiert, wodurch der L-Histidin Titer um den Faktor 5.8 erhöht werden konnte. Die teils-gezielte DS-FIA-MS/MS-Methode ermöglichte die Identifizierung von akkumulierendem L-Histidinol als Vorläufer für die L-Histidin-Bildung und Zwischenprodukte der Methionin-Biosynthese als Ziele für das metabolic engineering. Die statistische Analyse deutete darauf hin, dass neben dem bereits berichteten Purin- und Glycin-Stoffwechsel die Methionin-Biosynthese über die Regeneration des Tetrahydrofolat-Cofaktors an der L-Histidin-Bildung beteiligt sein könnte. Die entwickelten und validierten Werkzeuge in Form von Kultivierungsprotokollen, robotischen Arbeitsabläufen und Datenverarbeitungspipelines ermöglichten die Identifizierung des besten Produzenten, die Identifizierung von Medienbeschränkungen, die Übertragung des Prozesses auf den Labormaßstab und die Identifizierung potenzieller Ziele für künftige metabolic engineering-Ansätze im Hochdurchsatz.