Mechanisms and functional consequences of impaired keratin network formation in genetic skin disorders

Lehmann, Sonja Maria; Spehr, Marc (Thesis advisor); Leube, Rudolf (Thesis advisor); Zimmer-Bensch, Geraldine Marion (Thesis advisor)

Aachen : RWTH Aachen University (2022, 2023)
Doktorarbeit

Dissertation, RWTH Aachen University, 2022

Kurzfassung

Die Haut stellt eine der wichtigsten Barrieren des Körpers dar. Ihre äußerste Schicht, die Epidermis, besteht hauptsächlich aus differenzierenden Keratinozyten. Die Integrität der Epidermis wird zu einem großen Teil durch das Keratin-Intermediärfilament-Zytoskelett gewährleistet. Die Bedeutung dieses Netzwerks wird durch eine Reihe von Keratinmutationen untermauert, die Krankheiten wie Epidermolysis bullosa simplex (EBS) oder Pachyonychia congenita (PC) verursachen, welche durch Keratin 5/14- bzw. Keratin 6/16/17-Mutationen ausgelöst werden. EBS ist charakterisiert durch traumabedingte Blasenbildung, die auf die Zytolyse von Keratinozyten in der basalen Schicht der Epidermis zurückzuführen ist und die auf einer Strukturveränderung des Keratinnetzwerks beruht. Statt des Zytoplasma-durchspannenden filamentösen Netzwerks entstehen periphere Keratin-Granula. PC-Patienten hingegen zeigen eine Verdickung der Epidermis mit extremer Hyperkeratose an bestimmten Hautarealen, z. B. an den Fußsohlen. Ziel dieser Arbeit war es, Einblick in die verschiedenen Pathogenesen zu gewinnen, um zum einen durch Etablierung und Anwendung neu entwickelter Bildanalysewerkzeuge mutierte EBS-Keratin-Granula quantitativ zu beschreiben, und um zum anderen zu klären, ob die Autophagie von Mitochondrien, welche einen wesentlichen Schritt innerhalb der epidermalen Differenzierung darstellt, bei PC gestört ist. Mit Hilfe von Lebendzellmikroskopie von Epithelzellen, die Fluorophor-markiertes, mutiertes Keratin stabil überexprimieren, wurde eine automatisierte Tracking-Routine entwickelt. Sie ermöglichte eine detaillierte quantitative Analyse verschiedener dynamischer Parameter der mutierten Keratin-Granula. Insbesondere konnte gezeigt werden, dass die Granula zunächst im äußersten Lamellum der Epithelzellen gebildet werden. Anschließend wachsen sie bis zum Erreichen eines Plateaus und werden konstitutiv mit einer Geschwindigkeit von etwa 0,5 µm/min nach innen transportiert. Die meisten Keratin-Granula fusionieren mehrfach miteinander, bevor sie sich an der Grenze zwischen dem Lamellum und dem inneren Zytoplasma rasch auflösen. Ihr Transport ähnelt stark dem Aktin-Transport, und es konnte gezeigt werden, dass eine pharmakologische Hemmung des Aktin-Motorproteins non-muscle Myosin II ihre gerichtete Motilität deutlich verringert. Fluoreszenz-Bleich-Experimente zeigten weiterhin, dass die Granula lösliche Keratine schnell mit dem Zytoplasma und innerhalb der Granula selbst austauschen. Die Bildung von EBS-assoziierten Keratin-Granula beruht demzufolge auf dem Prinzip der Flüssig-Flüssig-Phasentrennung. Als nächstes wurde die Kinase DYRK untersucht, basierend auf ihrer Fähigkeit, verschiedene Flüssig-Phasen-Kondensate aufzulösen. Obwohl eine deutliche Kolokalisierung verschiedener überexprimierter DYRK-Isoformen und mutierter Keratin-Granula in Patienten-Keratinozyten gezeigt werden konnte, führte die pharmakologische Hemmung dieser Kinasen nicht zu einer Änderung des Prozentsatzes der Granula-positiven Zellen in verschiedenen Wildtyp-Keratinozyten-Zellklonen, die Fluorophor-markierte mutierte Keratine stabil überexprimieren. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden funktionelle Auswirkungen der mutierten Keratine auf die mitochondriale Integrität untersucht. Im Hinblick auf Makroautophagie von Mitochondrien wurde das mitochondriale Alter mit Hilfe eines Fluoreszenzreporters bestimmt. Es zeigte sich, dass PC-Zellen erhöhte Mengen an überalterten Mitochondrien enthalten, was bei EBS nicht der Fall war. Außerdem zeigte sich, dass die Kontaktstellen zwischen Mitochondrien und dem endoplasmatischen Retikulum in PC reduziert sind. Die Expression von frühen Mitophagie-Markern war nicht verändert, jedoch war der Abbau von Mitochondrien in PC-Keratinozyten stark beeinträchtigt. Obwohl die Keratinozyten in der Lage sind, Autolysosomen zu bilden, wurde gezeigt, dass sich diese Strukturen in PC stark anreichern. Die Analyse der Funktion von Lysosomen ergab eine verringerte enzymatische Kapazität, und der Phänotyp der Mitochondrien-Überalterung konnte durch pH-Veränderungen in Wildtyp-Zellen nachgeahmt werden. Daraus lässt sich schließen, dass der Prozess des autolysosomalen Recyclings, der im Anschluss an die Makroautophagie unerlässlich ist, in PC gestört ist, was zu einer beeinträchtigten Mitophagie führt. Insgesamt wurden im Rahmen dieser Arbeit neue Bildanalysewerkzeuge entwickelt, die eine detaillierte Quantifizierung der Dynamik mutierter Keratine ermöglichen, und es wurde entdeckt, dass mutierte Keratine die Mitophagie und das autolysosomale Recycling in PC-Keratinozyten modulieren.

Einrichtungen

  • Fachgruppe Biologie [160000]
  • Lehrstuhl für Chemosensorik [163310]

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