Synthesis of chiral diols relevant for biofuel and fine chemical production using synthetic enzyme cascades in diverse reaction conditions

Spöring, Jan-Dirk; Rother, Dörte (Thesis advisor); Blank, Lars M. (Thesis advisor)

Aachen : RWTH Aachen University (2022, 2023)
Doktorarbeit

Dissertation, RWTH Aachen University, 2022

Kurzfassung

Die Forschung auf dem Gebiet der Biokatalyse hat in den letzten Jahrzehnten stark zugenommen, vor allem aufgrund der Errungenschaften der Gentechnik. Die Motivation, die Biokatalyse für die Synthese von (Fein-)Chemikalien zu nutzen, liegt in der inhärent hohen Regio , Chemo- und Stereoselektivität, die die meisten Enzyme besitzen. Eine Herausforderung für die Anwendung von Enzymen in chemischen Prozessen war und ist teils weiterhin die Instabilität der Enzyme unter Prozessbedingungen, insbesondere bei der Verwendung von organischen Lösemitteln. Die meisten Enzymklassen sind so evolviert, dass sie in wässrigen Reaktionssystemen aktiv sind und in ihrer gereinigten Form in organischen Lösungsmitteln denaturieren. Ein Wechsel der Enzymformulierung zu z.B. gefriergetrockneten ganzen Zellen ermöglicht es den Enzymen, in diesen unkonventionellen Reaktionsmedien stabil zu bleiben und eröffnet neue Möglichkeiten für die Anwendung von Enzymen für organische Synthesen. In dieser Arbeit wurden konventionelle und unkonventionelle Reaktionsmedien für die Synthese von symmetrischen, aliphatischen, vicinalen Diolen aus biobasierten Aldehyden verwendet. Die Substrate Acetaldehyd, Propanal und Butanal wurden für eine zweistufige enzymatische Kaskade verwendet, bei der zunächst eine Carboligase und in einem zweiten Schritt eine Oxidoreduktase zur Synthese von 2,3-Butandiol, 3,4-Hexandiol bzw. 4,5-Octandiol eingesetzt wurde. Im wässrigen Medium wurden verschiedene Carboligasen und Oxidoreduktasen auf ihr Substratspektrum, ihre Aktivität und Stereoselektivität gegenüber dem Produkt und im Falle der Oxidoreduktasen auch gegenüber dem Substrat untersucht. Durch die Kombination verschiedener Lyasen mit Oxidoreduktasen in einem modularen Ansatz konnten acht von neun möglichen Stereoisomeren mit guten bis exzellenten Isomerengehalten (zwischen 68 % und >99 %) und in vielen Fällen auch mit annehmbaren Ausbeuten (zwischen 8,2 % und 54 %) erfolgreich hergestellt werden. Um zu zeigen, dass die Ausbeuten und Produktkonzentrationen weiter verbessert werden können, wurde (4S,5S)-Octandiol als Fallstudie für die Optimierung dieser Parameter verwendet. Als Engpass der Kaskade wurde das thermodynamische Gleichgewicht der Reduktionsreaktion identifiziert, das auf der Substratseite lag. Daher wurden höhere Konzentrationen des Cosubstrats zusammen mit einem erhöhten pH-Wert eingesetzt, der die Oxidationsreaktion des Cosubstrats begünstigt. Dadurch konnte die Ausbeute von 34 % auf 86 % gesteigert werden, und es wurde auch eine Hochskalierung durchgeführt, bei dem 127 mM Produkt mit ausgezeichneter Stereoselektivität hergestellt wurden. Die Produktaufarbeitung erwies sich als recht aufwändig aus den wässrigen Reaktionssystemen, da eine organische Extraktion durchgeführt werden musste, um das hydrophobe Produkt vom hydrophilen Cosubstrat, Coprodukt und Zelltrümmern wie Proteinen aus den ganzen Zellen zu trennen. Letztere bildeten während der organischen Extraktion eine Interphase, weshalb vor der Extraktion ein Proteinfällungsschritt mit HCl durchgeführt wurde. Diese Schritte könnten neben anderen Vorteilen entfallen, wenn man von einem wässrigen zu einem mikrowässrigen Reaktionssystem mit Cyclopentylmethylether (CPME) als Hauptlösungsmittel übergeht. Alle drei Kaskaden wurden sowohl unter wässrigen als auch unter mikro-wässrigen Bedingungen getestet und erwiesen sich in beiden Systemen als erfolgreich. Interessanterweise lieferte der hydrophile Acetaldehyd im wässrigen System höhere Produktkonzentrationen als im System mit organischem Lösungsmittel. Dies war wahrscheinlich auf den Verteilungskoeffizienten des reaktiven und in hohen Konzentrationen toxischen Acetaldehyds zurückzuführen, der sich auf der Seite der wässrigen Phase und damit direkt am Enzym im organischen System befand. Somit waren deutlich höhere Konzentrationen des reaktiven Acetaldehyds in der Umgebung des Enzyms vorhanden und inaktivierten es. Der umgekehrte Effekt war für das hydrophobe Butanal zu beobachten, bei dem das organische System zu höheren Ausbeuten führte als das wässrige System, was wahrscheinlich auf die höhere Substratlöslichkeit und damit Verfügbarkeit im organischen System zurückzuführen ist. Da Butanal im organischen System eine höhere Löslichkeit aufweist, konnten in einem Scale-up-Experiment im 200-mL-Maßstab höhere Substratkonzentrationen von bis zu 800 mM verwendet werden, was zu Butyroinkonzentrationen von über 250 mM und Produktkonzentrationen von 79 mM meso-4,5-Octandiol führte. Die Weiterverarbeitung unter organischen Bedingungen erwies sich als einfacher als aus dem wässrigen System, da die organische Extraktion entfallen ist. Auch der spezifische Energiebedarf für die Produktaufreinigung mittels Destillation konnte durch die Verwendung unkonventioneller Medien wie organischer Lösungsmittel oder biphasischer Medien um 79 % gesenkt werden. Schließlich wurde CPME für die Verbindung von Biokatalyse und Chemokatalyse für die Synthese von cyclischen Acetalen aus einfachen, biobasierten Aldehyden verwendet. Diese Hybridsysteme können die organischen Synthesen erheblich verbessern, indem sie die Vorteile der Bio- und der Chemokatalyse, wie Selektivität und breite Anwendbarkeit, miteinander verbinden. Im Allgemeinen unterscheiden sich die Reaktionsbedingungen der beiden Katalysatortypen erheblich, in diesem Fall insbesondere aufgrund der Wasserempfindlichkeit des Ruthenium-Katalysators und der geringen erforderlichen H2- und CO2-Löslichkeit in Wasser. Hier wurde erfolgreich gezeigt, dass CPME ein geeignetes Lösungsmittel für die Synthese von aliphatischen Diolen wie 3,4-Hexandiol und 4,5-Octandiol aus Aldehyden mit Hilfe von Enzymen und von 1,3-Dioxolanen aus diesen Diolen mit einem Rutheniumkatalysator mit Formiat oder CO2 als C1-Quelle und H2 ist. Zusammengefasst wurden enzymatische Zweistufenkaskaden für die Synthese von aliphatischen, vicinalen Diolen in wässrigen und unkonventionellen organischen Reaktionsmitteln eingesetzt. Es konnten sowohl sehr stereospezifische Synthesen als auch hohe Produktkonzentrationen erreicht werden. Organische Lösungsmittel wurden auch für die Verbindung von Bio- und Chemokatalyse verwendet. Dieses System kann in Zukunft für die Verbindung verschiedener enzymatischer Reaktionen mit verschiedenen wassersensitiven Chemokatalysatoren für die Synthese komplexerer und wertvoller Moleküle verwendet werden.