Etablierung einer Methode zur markerfreien Genom-Editierung in Magnaporthe oryzae und Charakterisierung der Virulenzfaktoren MoPl1 und MoNudix

Wegner, Alex Leander; Schaffrath, Ulrich (Thesis advisor); Panstruga, Ralph (Thesis advisor)

Aachen : RWTH Aachen University (2022, 2023)
Doktorarbeit

Dissertation, RWTH Aachen University, 2022

Kurzfassung

Der phytopathogene Pilz Magnaporthe oryzae, auch bekannt als Erreger des Reisbrands, infiziert wichtige, ökonomisch bedeutsame Süßgräser wie die Nutzpflanzen Reis, Gerste, Hirse und Weizen, deren Erträge einen Großteil der weltweiten Grundnahrungsmittelversorgung ausmachen. Bisher konnten Ernteausfälle oft durch die Verwendung von Pflanzenschutzmitteln, wie z. B. Fungiziden, minimiert werden. Durch deren intensive Nutzung wurde jedoch die Entwicklung resistenter Isolate begünstigt, wodurch deren Bekämpfung erschwert wird und deshalb neue Bekämpfungsstrategien gesucht werden. Um Pflanzen zu infizieren, sekretiert das Pathogen sogenannte Effektoren und Virulenzfaktoren. Diese sind für eine erfolgreiche Infektion essenziell und können u. a. das pflanzliche Immunsystem manipulieren. Die Erforschung von Effektoren und Virulenzfaktoren tragen zu einem besseren Verständnis der Pilz-Pflanzen-Interaktion bei. Für die Charakterisierung von Effektoren und Virulenzfaktoren werden unterschiedliche Methoden, wie z. B. die CRISPR/Cas9 vermittelte Genom-Editierung, angewendet, um die Effektor kodierenden Gene zu deletieren. Des Weiteren stellt die konstitutive Expression von Kandidatengenen einen weiteren Ansatz zur Charakterisierung von Effektoren dar. Aus den Phänotypen der generierten Genotypen lassen sich erste Rückschlüsse auf die Funktion des Effektors folgern. Da bei der gezielten Deletion eines Gens dieses meist durch einen Selektionsmarker ersetzt wird, ist die Anzahl von Gen-Deletionen in derselben Mutante bisher durch die Summe an zur Verfügung stehenden Selektionsmarkern limitiert. Dies schränkt die Charakterisierung von mehrfach in dem Genom vorkommenden Genen stark ein. Im Rahmen dieser Arbeit konnte das Repertoire an Selektionsmarkern für M. oryzae erweitert werden. Es konnte gezeigt werden, dass die fungizide Substanz Fenhexamid zusammen mit dem resistenzvermittelnden Gen FfERG27 als ein robustes, kostengünstiges und effizientes Selektionssystem für Magnaporthe-Transformanten verwendet werden kann. Um die Problematik der limitierenden Selektionsmarker zu umgehen, wurde des Weiteren eine Technik zur Selektion von Magnaporthe-Transformanten ohne einen in das Genom integrierenden Selektionsmarker für die gezielte Genom-Editierung in M. oryzae etabliert. Die entwickelte Methode basiert auf der Verwendung von Resistenzmarker-tragenden Telomervektoren, welche aufgrund von fehlenden, für die Replikation notwendigen Elementen, unter nicht selektiven Bedingungen schnell verloren gehen. Eine Kombination der CRISPR/Cas9-Technologie zusammen mit der Verwendung von Telomervektoren eröffnet eine Vielzahl neuer Ansatzmöglichkeiten zur Genom-Editierung des phytopathogenen Pilzes M. oryzae ohne einen integrierenden Selektionsmarker, welche in dieser Arbeit diskutiert werden. Anhand von künstlich erzeugten Gen-Deletionsmutanten und Mutanten, welche mRFP-markierte Kandidatengene konstitutiv unter der Kontrolle des rbp27-Promotors exprimieren, konnte für die Gene MoPL1 und MoNUDIX eine Beteiligung an der Virulenz nachgewiesen werden. Das Gen MoPL1, welches in der nekrotrophen Lebensphase des phytopathogenen Pilzes exprimiert wird, kodiert eine sekretierte Pektatlyase. Sowohl die Deletion wie auch die konstitutive Expression von MoPL1 führten zu einer verminderten Virulenz des Pathogens. Analysen wiesen darauf hin, dass die Kolonisierung des Pflanzengewebes bei beiden generierten Genotypen im Vergleich zu dem Ursprungsisolat vermindert war. Hierbei korrelierte die reduzierte Virulenz der Mutanten mit dem verstärkten Auftreten einer Papillenbildung und einem häufigeren hypersensitiven Zelltod der penetrierten Pflanzenzellen. Die verminderte Virulenz der Gen-Deletionsmutante kann mit dem Fehlen des lytischen Enzyms, das an der Penetration bzw. dem Zell-zu-Zellwachstum beteiligt sein könnte, erklärt werden. Bei der konstitutiven Expression des Gens ist die verminderte Virulenz wahrscheinlich auf die Generierung von sogenannten DAMPs (engl.: Danger Associated Molecular Patterns) zurückzuführen, die von der Pflanze wahrgenommen werden und das pflanzliche Immunsystem aktivieren. Eine Expression einer enzymatisch inaktiven Variante des Enzyms bestätigte, dass dem Abwehrmechanismus keine direkte Erkennung des Enzyms als PAMP (engl.: Pathogen-Associated Molecular Pattern) zugrunde liegt. Das Gen MoNUDIX kodiert ein Protein mit einer sogenannten NUDIX-Domäne, über dessen mögliche Rolle als Virulenzfaktor bereits in früheren Arbeiten diskutiert wurde. Transkripte dieses Gens akkumulierten fast ausschließlich 48 Stunden nach der Inokulation. Lokalisationsstudien mit einem mRFP markierten Fusionsprotein ließen eine Akkumulation des Proteins im Zellkern und im endoplasmatischen Retikulum erkennen. Somit scheint der Wirkungsort der Hydrolase nicht, wie für viele Effektoren üblich, in der Pflanzenzelle, sondern im Pilz selbst zu liegen. Mithilfe der CRISPR/Cas9-Technologie und zusätzlicher Resistenzmarker konnten erstmals Mutanten generiert werden, bei denen beide im Isolat M. oryzae Guy11 vorliegenden Paraloge des Gens deletiert werden konnten. Die generierten Gen-Deletionsmutanten wiesen auf Gerste, nicht aber auf Reis, eine stark verminderte Virulenz im Vergleich zum Wildtyp-Isolat auf, wobei sich dies hauptsächlich durch deutlich kleinere Läsionen äußerte. Im Rahmen dieser Arbeit konnten somit zwei Proteine identifiziert werden, die einen Einfluss auf die Virulenz von M. oryzae haben und zu einem besseren Verständnis der Pathogen-Pflanzen-Interaktion auf molekularer Ebene dienen. Die hier vorgestellten methodischen Verbesserungen hinsichtlich der Verwendung von Fenhexamid zur Selektion sowie der Einsatz einer Telomervektor basierten Methode ohne einen in das Genom integrierenden Selektionsmarker bei der Transformation von M. oryzae werden in Zukunft die Identifizierung weiterer Virulenzfaktoren deutlich erleichtern.

Einrichtungen

• Fachgruppe Biologie [160000]
• Lehrstuhl für Molekulare Pflanzenphysiologie [161510]