Development and plant-based expression of recombinant immunotoxins for the targeted treatment of myelomonocytic leukemia

• Entwicklung und pflanzen-basierte Expression rekombinanter Immuntoxine für die gezielte Behandlung der myelomonozytären Leukämie

Knödler, Matthias; Buyel, Johannes Felix (Thesis advisor); Blank, Lars M. (Thesis advisor)

Aachen : RWTH Aachen University (2023)
Doktorarbeit

Dissertation, RWTH Aachen University, 2023

Kurzfassung

Immunotoxine sind hochwirksame, biopharmazeutische Krebsmedikamente, die aus einem Antikörper und einem Wirkstoff bestehen und die therapeutische Wirksamkeit im Vergleich zu monoklonalen Antikörpern (mAks) verbessern können. Die Synthese von Antikörper-Wirkstoff-Konjugaten ist aufgrund der individuellen Produktion und Reinigung der Antikörper- und Toxin-Komponenten in Ovarialzellen des chinesischen Hamsters (CHO) bzw. durch chemische Synthese der toxischen Komponente sehr komplex. Außerdem sind ein chemisches Konjugationsverfahren und zusätzliche Reinigungsschritte erforderlich, was die Produktions- und Therapiekosten im Vergleich zu herkömmlichen mAks erhöht. Im Gegensatz dazu ist die Herstellung eines rekombinanten Fusionsproteins, das aus einem Antikörper (Fragment), einem Linker und einem protein-basierten Toxin besteht einfacher. Die Produktion solcher rekombinanten Immuntoxine (RITs) in Bakterien ist durch das limitierte Repertoire an bakteriellen post-translationalen Modifikationen (PTMs) problematisch. Pflanzen sind in der Lage alle relevanten PTMs zu erzeugen und wurden bereits erfolgreich zur Herstellung von biopharmazeutischen Proteinen wie mAks, Enzymen und aktiven Toxinen eingesetzt, wie z.B. das rekombinante Mistel-Lektin Viskumin.In dieser Arbeit wurden Pflanzen der Gattung N. benthamiana und N. tabacum sowie Tabak BY-2 Suspensionszellen für die Herstellung sogenannter "plant cell packs" (PCPs) verwendet, um wirksame RITs zu produzieren, die gezielt an CD64 Antigene binden und zur Therapie der myelomonozytären Leukämie eingesetzt werden können. Verschiedene Immuntoxin-kandidaten mit unterschiedlichen Bindedomänen, Linkern und protein-basierten Toxinen wurden gezielt in verschiedene subzelluläre Pflanzenorganellen exprimiert. Die Akkumulation ausgewählter Kandidaten wurde auf bis zu ~40 mg kg-1 Biomasse optimiert, und nach Optimierung einer Protein L Affinitätschromatographie mit einer Gesamtausbeute von 84% und einer Reinheit von < 80% isoliert. Für einen, auf dem Mistel-Toxin Viscumin basierenden Wirkstoffkandidaten, wurde die Stabilität sowie in vitro Aktivität in humanen Zelllinien der akuten und chronische myelomonozytären Leukämie überprüft. Mit einer mittlere inhibitorischen Konzentration (IC50) im unteren μM Bereich zeigte der Wirkstoffkandidat eine zufriedenstellende Aktivität gegen CD64+ Leukämiezellen für diesen Machbarkeitsnachweis. Auf der Grundlage unserer Studie haben wir relevante Herausforderungen der pflanzenbasierten Expressionsplattform identifiziert. Zudem konnte eine Kostenkalkulation eine wirtschaftliche Rentabilität der pflanzen-basierten Produktion von RITs für die Anwendung in der Krebstherapie verdeutlichen.

Einrichtungen

• Fachgruppe Biologie [160000]
• Lehrstuhl für Molekulare Biotechnologie [162910]