Functional ion channel characterization in the cnidarian nematostella vectensis

Foreman, Katharina Bernadette; Gründer, Stefan (Thesis advisor); Spehr, Marc (Thesis advisor)

Aachen : RWTH Aachen University (2023)
Doktorarbeit

Dissertation, RWTH Aachen University, 2023

Kurzfassung

Die Degenerin/Epithel Natrium Kanal Familie (DEG/ENaC) ist eine Superfamilie, die aus zahlreichen Ionenenkanälen mit diversen Funktionen besteht. Diese Kanäle werden in vielen unterschiedlichen Stellen in zahlreichen Organismen exprimiert. Was die Kanäle unter anderem verbindet ist die phylogenetische Verwandtschaft. Zu dieser Familie gehören die Säure-Sensitiven Ionenkanäle (ASICs), die durch Protonen aktiviert werden und Na+ Ionen leiten. ASICs sind unter anderem involviert in Schmerzempfinden. Eine weitere Subfamilie bilden die Epithel Natrium Ionenkanäle (ENaCs), die konstitutiv geöffnet sind, und die an der Na+-Wiederaufnahme involviert sind. Des Weiteren gehört der FMRFamide-Peptid-Gesteuerte Natriumkanal FaNaC zu dieser Familie, ebenso wie der kürzlich entdeckte Hydra Natriumkanal 2/3/5 (HyNaC 2/3/5). Beide reagieren auf die Bindung eines Peptids und leiten Na+. Generell bilden alle diese Kanäle Trimere, wobei ASICs zum Beispiel Homo-Trimere bilden und ENaCs Hetero-Trimere. Auch wenn sie diverse Funktionen haben, haben diese Kanäle auch viele Gemeinsamkeiten, wie z.B. hohe strukturelle Homogenität. DEG/ENaCs bestehen grundsätzlich aus zwei Transmembrandomänen, verbunden durch einen großen extrazellulären Loop. Diese Kanäle sind grundsätzlich selektiv für Na+ und werden durch Amilorid inhibiert. Durch phylogenetische Analyse haben wir eine neue Subfamilie im Modellorganismus der Seeanemone Nematostella vectensis entdeckt. N. vectensis gehört zur Gruppe der Anthozoa, Teil des Phylums Cnidaria (Nesseltiere). Cnidaria gilt als einer der ältesten Stämme in der Evolution, der Organismen mit einem entwickelten Nervensystem enthält. Ein Kollaborationsprojekt wurde gestartet, zusammen mit der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Yehu Moran in Israel (Jerusalem). Gemeinsam, haben wir neunzehn Nematostella Ionenkanäle in Xenopus laevis Expressionsvektoren kloniert, welche wir NeNaC1 bis 24genannt haben (Nematostella Natriumkanal). Das Hauptziel dieser Studie war, die Funktion dieser NeNaCs zu erforschen. Basierend auf der Hypothese, dass einige Kanäle Peptid-Gesteuert sind, haben wir zahlreiche Peptidkandidaten getestet, die wir aus Literaturstudien selektiert haben. Des Weiteren haben wir alle verfügbaren NeNaCs nahe der zweiten Transmembrandomäne so mutiert, dass sie konstitutiv geöffnet sind, um ihre Zusammensetzung in einer kontrollierten, non-physiologischen Umgebung erforschen zu können. Wir konnten erkennen, dass alle funktionalen NeNaCs Homomere bilden. Obwohl wir keine Peptid-Gesteuerten Kanäle identifizieren konnten, haben wir herausgefunden, dass NeNaC2 ein Protonen-Sensitiver Ionenkanal ist, mit biphasischer Stromkinetik. NeNaC2 wird in Nesselzellen exprimiert, welche die Seeanemone nutzt um ihre Beute zu fangen. Dies impliziert, dass der Kanal bei Fress- und Jagdverhalten beteiligt sein könnte. Außerdem konnten wir feststellen, dass NeNaC2 sowohl von Amilorid als auch von Diminazene inhibiert wird, wobei der Kanal stärker durch Diminazene inhibiert wurde. Wir haben auch die Ionenselektivität bestimmt, und konnten erkennen, dass NeNaC2 ein moderat selektiver Kanal für Na+ ist der auch schwach permeabel für Ca2+ ist. Um mehr über die H+ Bindestelle zu erfahren, haben wir NeNaC2 His141 zu einem Alanin mutiert, wobei der Strom nicht komplett beseitigt werden konnte, aber deutlich reduziert wurde. Ansonsten konnten wir noch NeNaC8 charakterisieren, ein konstitutiv geöffneter Ionenkanal. Hierfür haben wir die extrazelluläre Konzentration von Ca2+ manipuliert. Dabei konnten wir feststellen, dass NeNaC8 dem BASIC Kanal sehr ähnlich ist, da er auch von physiologischen Konzentrationen an extrazellulären Ca2+ inhibiert zu werden scheint. Inhibierungskinetik von Amilorid und Diminazene wurde auch charakterisiert. Außerdem haben wir NeNaC14 charakterisiert, einen weiteren Protonen-sensitiven Kanal. Dieser Kanal ist weitaus weniger sensitiv für Protonen als NeNaC2, was impliziert, dass Protonen vermutlich nicht der physiologische Ligand sind.

Einrichtungen

• Fachgruppe Biologie [160000]
• Lehrstuhl für Chemosensorik [163310]
• [512000-2]