The analysis of fluorescence fluctuations by means of the mean single-molecule rate (mSMR)

Sparrenberg, Lorenz Tim; Schwaneberg, Ulrich (Thesis advisor); Berlage, Thomas (Thesis advisor)

Aachen : RWTH Aachen University (2023)
Doktorarbeit

Dissertation, RWTH Aachen University, 2023

Kurzfassung

Die Fluoreszenzfluktuationsspektroskopie (FFS) ist ein wichtiges Werkzeug für die Analyse biologischer Systeme auf Einzelmolekülebene. Über die Jahre wurden verschiedene Methoden entwickelt, die auf dem Prinzip der FFS beruhen. Sie lassen sich grob in zwei Kategorien einteilen. Methoden der ersten Kategorie untersuchen Fluktuationen in der Zeitdomäne und umfassen u.a. die bekannte Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) und ihre Varianten. Methoden der zweiten Kategorie analysieren Fluktuationen in der Amplitudendomäne, wozu z.B. das photon counting histogram (PCH) gehört. In dieser Arbeit wird eine neue Methode entwickelt, die Informationen aus beiden Domänen vereint, die mean single-molecule rate (mSMR). Sie basiert auf Mandels Q-Parameter, der aus den ersten beiden Kumulanten einer Fluoreszenzspur berechnet wird. Die Kumulanten können für beliebige Aggregationszeiten einer Fluoreszenzspur ausgedrückt werden, wodurch sich der Q-Parameter als zeitabhängige Größe ergibt. Durch eine Normierung zeigen die Q-Parameter für verschiedene Aggregationszeiten eine große Ähnlichkeit mit den Autokorrelationskurven der FCS-Analyse, was eine vergleichbare Interpretation der Daten ermöglicht. Durch die Definition der mSMR über Kumulanten, können aber auftretende Detektorartefakte korrigiert werden, was eine bessere Modellanpassung für die betroffenen Zeitskalen ermöglicht. Um die mSMR als neue Methode für die FFS-Analyse zu etablieren, wird sie in dieser Arbeit systematisch untersucht. Zunächst werden simulierte Fluoreszenzspuren analysiert. Es zeigt sich, dass die mSMR die Simulationsparameter auch bei Vorliegen von Rauschen und Detektorartefakten exakt reproduzieren kann. Für die anschließende Analyse von Fluoreszenzspuren des Farbstoffs Alexa Fluor 488 kommt ein selbstgebauter konfokaler Plate Reader zum Einsatz. Dieser führt automatisch FFS-Messungen in einer 384-Well Mikrotiterplatte durch und erlaubt dadurch schnelle und wiederholbare Messungen. Bei der Analyse der Fluktuationen liefern die mSMR und die etablierte FCS vergleichbare Ergebnisse. Auf kurzen Zeitskalen erbringt die mSMR aber bei Messungen mit wenigen Photonenereignissen plausiblere Ergebnisse. Zum Schluss wird die mSMR für die Analyse von DNA-Mischungen mit definierter Fragmentlängenzusammensetzung verwendet und Kalibrierkurven erhoben. Basierend auf diesen Ergebnissen werden DNA-Sequenzierbibliotheken charakterisiert und die Massenkonzentration, die mittlere Fragmentlänge sowie die Molarität der Proben bestimmt. Dabei liefert die mSMR vergleichbare Ergebnisse wie das übliche mehrstufige Verfahren aus Fluoreszenzspektroskopie und Kapillargelelektrophorese. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass die mSMR eine sinnvolle Erweiterung der bisherigen FFS-Methoden darstellt. Insbesondere für Messungen mit wenigen Photonenereignissen stellt die mSMR eine robuste und zuverlässige Methode dar. Durch die Korrektur von Detektorartefakte kann die mSMR auch Fluktuationsereignisse auf sehr kurzen Zeitskalen auflösen und so genauere Analysen von photokinetischen Effekten ermöglichen.

Einrichtungen

• Fachgruppe Informatik [120000]
• Lehr- und Forschungsgebiet Life Science Informatik (Fraunhofer FIT) [122620]
• Fachgruppe Biologie [160000]
• Lehrstuhl für Biotechnologie [162610]