Synthetic phenylpropanoid pathway for the in vivo production of coniferyl alcohol in Escherichia coli

• Synthetischer Phenylpropanoidweg zur in vivo-Produktion von Coniferylalkohol in Escherichia coli

Kohl, Anna Christiane; Commandeur, Ulrich Heinrich (Thesis advisor); Blank, Lars M. (Thesis advisor)

Aachen : RWTH Aachen University (2023)
Doktorarbeit

Dissertation, RWTH Aachen University, 2023

Kurzfassung

Lignane stellen eine wertvolle Substanzgruppe dar, welche viele gesundheitsfördernde Effekte auf den menschlichen Körper als potenzielle Pharma- und Nutrazeutika besitzen. Eines der bekanntesten Lignane ist (−)-Podophyllotoxin, das als semisynthetisches Derivat für die Behandlung verschiedener Krebsarten eingesetzt wird. Der industrielle Bedarf nach alternativen Produktionswegen ist weiterhin hoch, da die Hauptmethode der Extraktion immer noch von gefährdeten Pflanzen als Ressource abhängt. Deswegen könnte eine kontrollierte mikrobielle Fermentation die wichtigen Lignane in ausreichenden und skalierbaren Mengen zukünftig bereitstellen. Als eine Voraussetzung muss der Vorläufer der Lignansynthese Coniferylalkohol als industrielle Massenware produziert werden. Für eine vor allem kosteneffiziente und wirtschaftlich nachhaltige, grüne Synthese von Coniferylalkohol kann eine Fermentation aus günstigen Rohstoffen wie Glucose, durchgeführt in einem gut untersuchten Produktionsstamm wie Escherichia coli (E. coli) vorteilhaft sein, auch im Hinblick auf eine mögliche kombinierbare Synthese von Lignanen. Die Zielsetzung dieser Dissertation war es, eine mikrobielle Synthese von Coniferylalkohol in E. coli ausgehend von L-Tyrosin oder L-Phenylalanin nach dem pflanzlichen Phenyl-propanoidweg zu etablieren. Im Rahmen von Metabolic Engineering wurden zuerst verschiedene Enzymkandidaten für die wesentlichen zentralen Reaktionsschritte hinsichtlich Desaminierung, C3- und C4-Hydroxylierung und Methylierung evaluiert. Durch die Einteilung des Phenylpropanoidweges in vor- und nachgelagerten Syntheseweg wurden die besten Enzymkombinationen für beide Module untersucht. Die gesamte oder teilweise plasmid-basierte Expression des Phenylpropanoidweges wurde zudem in E. coli BL21(DE3) oder seinen genomintegrierten Abkömmlingen, welche unterschiedliche Genkopien und Promotoren enthalten, umgesetzt. Zuletzt wurden zwei verschiedene Zellassays angewandt und verglichen. Diese Doktorarbeit beschreibt die erste erfolgreiche Anwendung der TALs Flavobacterium johnsoniae (FjTAL) sowie Saccharothrix espanaensis (Sesam8), des Cytochrom P450 Enzyms Rhodopseudomonas palustris (CYP199A2) als C3H und den zwei Methyltransferasen aus Zea mays für die Produktion von Coniferylalkohol aus L-Tyrosin in E. coli. Hervorzuheben ist, dass Kaffeesäure aus L-Phenylalanin zum ersten Mal gewonnen wurde, indem die Bifunktionalität der F185L Mutante von CYP199A2 als C3- und C4-Hydroxylase (C3H/C4H) und die TAL von Rhodotorula glutinis (RgTAL) verwendet wurden. Schließlich konnte die höchste Menge an Coniferylalkohol (~ 850 µM) in wachsenden E. coli-Zellen eines genomintegrierten Stammes erreicht werden. Dieser Titer an Coniferylalkohol, welcher unter nicht-optimierten Bedingungen und in einem Prototypenstamm erzeugt wurde, ist mit einem Literaturwert vergleichbar, bei welchem ein L-Tyrosin überproduzierender Stamm und angepasste Kultivierungsbedingungen eingesetzt wurden. Die Ergebnisse dieser Dissertation schaffen somit eine substanzielle Basis für die Weiterentwicklung einer mikrobiellen Coniferylalkohol-Produktionsplattform.

Einrichtungen

• Fachgruppe Biologie [160000]
• Lehrstuhl für Molekulare Biotechnologie [162910]