Investigation of protein secretion in microscale cultivation systems with novel tools

Müller, Carolin; Oldiges, Marco (Thesis advisor); Blank, Lars M. (Thesis advisor)

Aachen : RWTH Aachen University (2023)
Doktorarbeit

Dissertation, RWTH Aachen University, 2023

Kurzfassung

Bis heute ist es nicht möglich, ein geeignetes Signalpeptid für die Sec-abhängige Sekretion heterologer Proteine in Gram-positiven Bakterien vorherzusagen. Stattdessen müssen Signalpeptide für jeden Wirt und jedes Zielprotein unter Prozessbedingungen getestet werden. Darüber hinaus können auch die Ribosomen-Bindungsstelle und insbesondere der Spacer zwischen der Shine-Dalgarno-Sequenz und dem Startcodon des Signalpeptids die Proteinsekretion beeinflussen. Um die Identifizierung geeigneter Signalpeptid-Zielprotein-Kombinationen zu beschleunigen, wurden automatisierte Arbeitsabläufe für die gezielte Stammkonstruktion und das Hochdurchsatz- Screening für die heterologe Proteinsekretion in Corynebacterium glutamicum etabliert, die an verschiedene Zielproteine angepasst werden können. Eine Plasmidbibliothek mit verschiedenen Bacillus subtilis Signalpeptiden wurde mit dem neu entworfenen pPBEx2-basierten Plasmid pCMEx12 konstruiert, das den Austausch der Ribosomenbindungsstelle einschließlich der Spacer-Sequenz sowie der Signalpeptidsequenz durch Kassettenmutagenese ermöglicht. Bei dieser Methode werden die Inserts als hybridisierte Oligonukleotide bereitgestellt, die nicht vollständig komplementär sind, sondern Überhänge aufweisen, die mit einem entsprechenden restriktionsverdauten pCMEx-Plasmid ligiert werden können. Für die Sekretion des Zielproteins kann in pCMEx-basierten Plasmiden das Reportergen, das für ein blaues Chromoprotein unter der Kontrolle eines konstitutiven Promotors kodiert, durch Golden Gate Assemblierung mit dem gewünschten Gen ausgetauscht werden, wobei Restriktion und Ligation in einem Prozessschritt kombiniert werden. Da das Chromoprotein nach der Transformation zu blauen Kolonien führt, kann eine erfolgreiche Klonierung durch eine Änderung der Koloniefarbe von blau nach weiß nachgewiesen werden, zusätzlich zu einem Restriktionsenzym-Testverdau, bei dem die Anzahl und Größe der DNA-Fragmente vom Insert abhängt. Das Zielgen wird dann zusammen mit einem aminoterminalen Signalpeptid mit einem kurzen Linker und einem Carboxy-terminalen 11. β-Faltblatt des grün fluoreszierenden Proteins (GFP, GFP11-tag) unter der Kontrolle des induzierbaren tac-Promotors exprimiert. Mit Hilfe eines Opentrons OT-2 Pipettierroboters mit integriertem Temperatur- oder Magnetmodul wurden die Klonierungsschritte Golden Gate Assemblierung, Escherichia coli Hitzeschock-Transformation, Plasmidreinigung und Testverdauung automatisiert. Dadurch konnte die Prozesszeit für diese Klonierungsschritte auf etwa 58% der Zeit für den manuellen Prozess reduziert werden. Zum Testen von Workflows für die Kultivierung mit Online-Produktmessung wurde der Stamm C. glutamicum pPBEx2-PhoDCg-GFP erfolgreich erstellt, der eine streng kontrollierte Induktion der GFP-Sekretion ermöglicht. Ein automatisierter Hochdurchsatz-Screening Workflow wurde auf einer Tecan Freedom EVO® Robotikplattform entwickelt mit integrierter Zentrifuge, Mikroplattenlesegerät und einem BioLector® für die Mikrokultivierung mit Online-Messung des Rückstreusignals, das mit dem Zelltrockengewicht korreliert. Die automatisierte Handhabung der Vorkulturen und die durch Rückstreuung ausgelöste Inokulation der Hauptkulturen und Induktion gewährleisten eine hohe Vergleichbarkeit des Bakterienwachstums. Mit diesem Workflow wurden geeignete Kombinationen von Ribosomenbindungsstellen und B. subtilis Signalpeptiden für die Sekretion der Fusarium solani f. sp. pisi Cutinase-GFP11 mit C. glutamicum identifiziert. Cutinase-GFP11 im Kultivierungsüberstand wurde 4 h nach Induktion durch Aktivitätsmessung und aktivitätsunabhängig durch Assemblierung des GFP11-tags mit GFP1-10 in der zugegebenen Detektorlösung mit anschließender Chromophorbildung im Split GFP Assay nachgewiesen. Die Prozessdauer von der Kultivierung von bis zu 12 verschiedenen Stämmen bis zum Nachweis des Zielproteins im Überstand beträgt etwa 1,5 Tage, wobei manuelle Eingriffe nur zu Beginn der Kultivierung und vor den Assays erforderlich sind. Für Hochdurchsatz-Screenings werden ausreichende Mengen an Detektorlösung benötigt. Daher wurde ein Fed-Batch Kultivierungsprozess für die GFP1-10 Produktion im Labormaßstab in Bioreaktoren etabliert und es konnte Detektorlösung für bis zu 385 Screenings in 96-Well-Platten gewonnen werden. Aspekte der Stabilität des GFP1-10 Detektorproteins, der Lagerung und der Assay-Inkubationsbedingungen wurden untersucht. Nach einem Proof-of-Concept mit der Cutinase, einem Modellprotein für die heterologe Proteinsekretion, wurde ein B. subtilis Signalpeptid-Screening für die Sekretion der Polyethylenterephthalat-abbauenden Enzyme Leaf-branch compost cutinase (LCC) und PE-H durchgeführt. Dafür wurde die Kultivierung optimiert, um den Vergleich von bis zu 24 verschiedenen Stämmen in einem Durchgang zu ermöglichen. Mit Hilfe eines Prozessmodells, das Bayes’sche Inferenz und Thompson-Sampling kombiniert, wurde das beste von 24 Signalpeptiden mit einer Wahrscheinlichkeit von 80% für die PE-H und 75% für die LCC nach nur drei Batch-Kultivierungen identifiziert.

Einrichtungen

• Fachgruppe Biologie [160000]
• Lehrstuhl für Biotechnologie [162610]