Assessment of a novel high-throughput process development platform for biopharmaceutical protein production

• Einschätzung einer neuen Hochdurchsatz-Prozessentwicklungsplattform für die biopharmazeutische Proteinproduktion

Opdensteinen, Patrick; Buyel, Johannes Felix (Thesis advisor); Schillberg, Stefan Johannes (Thesis advisor)

Aachen : RWTH Aachen University (2023)
Doktorarbeit

Dissertation, RWTH Aachen University, 2023

Kurzfassung

Pflanzen können etablierte Expressionssysteme wie Escherichia coli und "Chinese hamster ovary" (CHO) Zellen im Kontext von Infektionskrankheiten durch zusätzliche Produktionskapazitäten ergänzen. Im Vergleich zu diesen Systemen sind jedoch nur wenige Hochdurchsatz-Screening-Tools verfügbar, die die Entwicklung von Biopharmazeutika in Pflanzen erleichtern. Um diesen Zustand zu verbessern, wurden Hochdurchsatztechniken während der Klonierung, Expression, Reinigung und Quantifizierung implementiert, um den Durchsatz während des gesamten Entwicklungsprozesses zu erhöhen. Dieses Konzept wurde auf eine transiente Expression in Nicotiana spp. angewandt, da transiente Produktionsprozesse in nur 3 Wochen etabliert werden können und damit schnell auf neue Anforderungen reagieren können. Kombiniert mit statistischer Versuchsplanung ermöglichten es die etablierten Hochdurchsatz-Screening-Tools Kombinationen von Promotoren, 5' UTRs und Signalsequenzen zu identifizieren, die die Akkumulation von Zielproteinen maximieren. Diese Strategie wurde eingesetzt, um Interleukine, Polyphosphatkinasen, IgG3-Antikörper, Biofilm-abbauende Enzyme und Endolysine für eine holistische Strategie gegen Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus (MRSA) herzustellen. Durch das systematische Screening von Vektorelementen wurde in Pflanzen eine dreifach höhere IgG3-Akkumulation erreicht als in der Literatur beschrieben. Dispersin B erreichte Akkumulationslevel äquivalent zu E. coli. Weitere Verbesserungen können in Zukunft durch die Erweiterung der untersuchten Vektorelemente, insbesondere mit synthetischen Promotoren, 3' UTRs und Terminatoren erreicht werden. Die aus Pflanzen gewonnenen Zielproteine waren funktionsfähig, mit Ausnahme einer verminderten Aktivität von Polyphosphatkinasen, was dafürspricht, dass Nicotiana spp. rekombinante Proteine zur Bekämpfung von MRSA produzieren kann. Mit Hilfe der etablierten Screening-Tools können in Zukunft weitere Proteine in Pflanzen produziert und auf ihre Aktivität gegen MRSA untersucht werden. Basierend auf einem aktuellen Ansatz in der Entwicklung von Biopharmazeutika wurden Parametern identifiziert, die die Auswahl von Proteinkandidaten und Optimierungsstrategien leiten können. So erlaubte beispielsweise der Ursprung eines Zielproteins eine Vorauswahl geeigneter Expressionskompartimente und eine Verringerung des Screening Aufwandes. Die Bewertung der intrinsischen Proteinstabilität ermöglichte es, ungeeignete Proteinkandidaten innerhalb einer Proteinklasse auszusortieren. Die Medium Osmolalität (Wasser Aufnahme) kann für die Optimierung von Medien für die Pflanzenzellkultur herangezogen werden. Die Charakterisierung von Wirtszellproteinen, die nach der Chromatographie bestehen blieben, ermöglichte die Entwicklung von Reinigungsstrategien, die ihre Entfernung erleichtern.

Einrichtungen

• Fraunhofer-Institut für Molekularbiologie und Angewandte Ökologie - IME [053400]
• Fachgruppe Biologie [160000]
• Lehrstuhl für Molekulare Biotechnologie [162910]