Anaerobic cultivation of human and mouse gut bacteria : new approaches and novel diversity

Afrizal, Afrizal; Pabst, Oliver (Thesis advisor); Blank, Lars M. (Thesis advisor); Clavel, Thomas (Thesis advisor)

Aachen : RWTH Aachen University (2023)
Doktorarbeit

Dissertation, RWTH Aachen University, 2023

Kurzfassung

Die den menschlichen Körper besiedelnde Mikrobiota, spielen für die Gesundheit des Menschen eine entscheidende Rolle, welche von der Regulation der Immunantwort bis hin zur psychischen Gesundheit reicht. Die meisten Mikroorganismen befinden sich hierbei im Darm. Obwohl Pilze, Viren und Makrobiota (z. B. Helminthen) den Darm besiedeln, stellen Bakterien den Großteil dieses mikrobiellen Ökosystems dar. Ein erheblicher Teil von ihnen ist jedoch noch unbekannt und verfügt über keine repräsentativen Isolate in Kultursammlungen, was ein tieferes Verständnis ihrer Funktionen und Interaktionen mit dem menschlichen Körper erschwert. Daher hat die Kultivierung von Darmbakterien in den letzten fünf Jahren an Bedeutung gewonnen, beruht aber immer noch auf klassischen plattenbasierten Methoden. Technologien basierend auf Mikrofluidik bieten neue Möglichkeiten, anaerobe Darmbakterien zu isolieren. Sie ermöglichen die Isolierung einzelner Zellen ohne Färbung oder Behandlung, welche Einfluss auf die Lebensfähigkeit der Zellen haben kann. Die Vorkultivierung fäkaler mikrobieller Gemeinschaften vor der Isolierung ist sowohl für die Erweiterung des Spektrums der bakteriellen Vielfalt als auch als Grundlage für die Auswahl des Kulturmediums nützlich. In meiner Arbeit habe ich gezeigt, dass die Vorkultivierung in zehn handelsüblichen Medien fast 90% der durch Amplikon-Sequenzierung detektierten molekularen Spezies (OTUs, Operational Taxonomic Units) in Stuhlproben erfasst wurden. Zusätzlich konnten aus diesen Proben 21 zuvor nicht detektierte Isolate nachgewiesen wurden. Eine Kombination der drei besten Medien ermöglichte es, 78% der fäkalen OTUs zu erfassen und 16 bakterielle Spezien anzureichern, die nicht in den Stuhlproben nachgewiesen wurden. Aufgrund von Schwierigkeiten bei der Extraktion von Zellen aus dem Chip erwiesen sich die Mikrofluidik-Chips allerdings als ungeeignet für eine effiziente Isolierung anaerober Darmbakterien. Des Weiteren gab es auch Probleme beim Erfassen von Zellen und Biofouling. Im Gegensatz dazu wurde die auf Tröpfchenmikrofluidik basierende Einzelzelldispensierung (SCD) erfolgreich zur Isolierung von Darmanaerobiern eingesetzt. Die Isolierungsleistung und die erfasste Diversität waren mit der klassischen Agarplattenmethoden vergleichbar, jedoch mit dem Vorteil, dass diese für die Gewinnung von Reinkulturen erforderliche Inkubationszeit erheblich verkürzt wurde (von 21 auf 5 Tage). Aus mehreren SCD-basierten Experimenten wurde eine Sammlung menschlicher Darmbakterien erstellt. Diese aus 81 Isolaten bestehende Sammlung, weist 65 Spezies auf, wobei darunter zusätzlich 16 neue Arten entdeckt und taxonomisch beschrieben wurden. In einem separaten Kultivierungsprojekt wurde die Bakteriensammlung für den Mausdarm (miBC) (www.dsmz.de/miBC) von 100 Isolaten (76 Arten) auf 212 Isolate (161 Arten) erweitert, wozu hauptsächlich die klassische Agarplattenisolierung eingesetzt wurde. Darunter waren 44 Isolate, die zu 39 neuen Arten, 10 neuen Gattungen und einer neuen Familie gehören. Ein einfacher Zellgrößenausschlußschritt vor der Isolierung durch Filtrieren von Fäkalschlamm (0,45 µm Membranfilter) erwies sich als eine wirksame Methode zur Isolierung von Mucispirillum schaedleri und mehreren neuen Bakterien, einschließlich Mitgliedern der neuen Familie. Meine Arbeit an der Darmmikrobiota von Menschen und Mäusen ermöglichte ein besseres Verständnis der kultivierten Fraktion innerhalb dieser mikrobiellen Ökosysteme. Die Bulk-Amplikon-Sequenzierung aller Kolonien, die sich nach dem SCD einer Fäkalprobe auf den Platten gebildet hatten, ergab eine durchschnittliche Erfassung von 52,2% der OTUs, welche 82% der kumulativen relativen Abundanz entspricht. Ein Vergleich der erweiterten miBC mit zwei anderen Mäusesammlungen (mGMB und MGBC) ergab, dass sich nur ca. 30 % der Arten mit den anderen Sammlungen überschneiden, was auf eine Heterogenität der Mikrobiota in verschiedenen Einrichtungen oder geografischen Regionen hinweist. Die Abdeckung der 16S rRNA-Genamplikondaten aus Mausdarm-Proben war bei miBC-Isolaten generell geringer als bei mGMB, stieg jedoch beträchtlich, wenn beide Sammlungen kombiniert wurden. Darüber hinaus deckte miBC allein fast 40 % der gesamten Proteine in den metagenomischen Genkatalogen der Maus ab. Mit der Kombination aller drei Sammlungen erreichte diese funktionelle Abdeckung 53,5 %. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Tröpfchenmikrofluidik in Kombination mit der Vorkultivierung das Potenzial hat, plattenbasierte Kultivierungsverfahren zu verbessern, ohne deren Leistung zu beeinträchtigen. Diese Arbeit hat dazu beigetragen, öffentliche Sammlungen von Darmbakterien der Menschen und Mäusen zu erweitern, welches für die wissenschaftliche Gemeinschaft von großem Vorteil ist und die Untersuchung von Mikroben-Wirt-Interaktionen erleichtert. Die gründliche Beschreibung neuer Bakterientaxa, wie sie hier durchgeführt wurde, verringert den unbekannten Anteil der bakteriellen Gemeinschaften im Darm. Weitere Bemühungen sind erforderlich, um den Durchsatz der Mikrofluidik-basierten Bakterienkultivierung weiter zu erhöhen. Dies wird neue Wege für die personalisierte mikrobiombasierte Forschung eröffnen.

Einrichtungen

• Fachgruppe Biologie [160000]
• Lehrstuhl für Angewandte Mikrobiologie [161710]
• [526000-2]